「特醫檢測」特醫食品中維生素 A、D、E的測定
營養科技特醫
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解決方案提供者
營養科技 lbyykj
工 程 師 介 紹
王巧娟
渭南師範學院化學專業
營養科技檢測工程師
擅長特醫食品中維生素 A、D、E的測定
維生素是維持機體正常生理功能及細胞內特異代謝反應所必需的一類微量低分子天然有機化合物。
維生素A與正常視覺有密切關係，為骨骼正常生長所必需，有助於細胞的增生與生長，並對上皮的正常形成，發育以及維持十分重要;維生素D能促進小腸對鈣的吸收，其代謝活性物促進腎小管重吸收磷和鈣，提高人體血漿鈣和磷的濃度，或維持及調節血漿鈣、磷正常濃度;維生素E能促進生殖,它能促進性激素分泌,使男子精子活力和數量增加;使女子雌性激素濃度增高,提高生育能力,預防流產。
方法原理
GB 5413.9-2010 《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定》
維生素 A、D、E的測定原理：
試樣皂化后，經石油醚萃取，用液相色譜法分離，外標法定量。
檢測試樣
試樣：腸內營養混懸液
試劑與材料
除非另有規定，本方法所用試劑均為分析純或以上規格，水為GB/T 6682規定的一級水。
• 無水硫酸鈉：化學純
• 乙醇：色譜純
• 氫氧化鉀：化學純
• 石油醚：沸程30 ℃～60 ℃，化學純
• 甲醇：色譜純
• 維生素C ：分析純
• 維生素A標準品：視黃醇
• 維生素E標準品：α-生育酚
• 維生素D3標準品：膽鈣化醇
儀器和設備
• 二維高效液相色譜儀（一維：四元泵，二維：二元泵），帶紫外檢測器（一維）和二級管陣列檢測器（二維）
• 旋轉蒸發器
• 恆溫震蕩空氣浴搖床：55℃
• 氮吹儀
• 超聲波清洗器
• 天平：感量為 0.1 mg
• 聚四氟乙烯漏斗
• 500ml分析漏斗
• 快速濾紙
• 分液漏斗木頭架
• 分液漏斗振搖器
分析步驟
皂樣處理
1.皂樣
流食35g /粉劑5-10g於250mL三角瓶
↓
4.5g抗壞血酸
↓
混合均勻 ，加入50ml（40 ℃左右）水溶解
↓
加入100ml無水乙醇，混合均勻
↓
蓋上膠塞，避光超聲10min
↓
加入氫氧化鉀（KOH:H2O=1:1）25ml
↓
確保55℃下皂化55min
↓
(確保塞子塞緊，每隔20min觀察，準備好冰水)
↓
結束后立即冰水立即冷卻
2.提取
皂化液轉入500ml分液漏斗，用150ml石油醚提取於分液漏斗振搖器振搖5min，靜止5min分層
↓
分層後轉移至另一個分液漏斗，加100ml石油醚同法萃取，合併醚液，
↓
水洗有機相3次至中性
↓
醚液過無水硫酸鈉，用250ml雞心瓶收集。
↓
40℃旋蒸蒸發
↓
旋蒸至1ml左右，用約5ml石油醚洗待測組分於50ml塑料離心管，氮吹儀吹乾。
↓
用10ml色譜甲醇復溶解，渦旋混合儀混勻。
↓
樣品過0.22μm濾膜，上HPLC，（-20℃保存3天）
注意：醚液合併後用石油醚洗分液漏斗3次洗液倒入有機相中；醚液過完後用石油醚洗分液漏斗3次洗液過無水硫酸鈉。
操作注意事項
1.維生素A、D、E在強光下易分解，實驗應在避光的條件下進行。
2.提取過程中石油醚其蒸氣或霧對眼睛、粘膜和呼吸道有刺激性，應在通風櫥中進行。
3.提取過程中應注意分液漏斗排氣。
4.旋轉蒸發時決不允許蒸干，以免被測樣品含量有損失,氮吹乾時，氮氣不能開得太大，避免樣品吹出瓶外，導致結果偏低。
5.實驗過程中試樣的轉移需要完全徹底，以減少損失。
6.選擇合適的皂化條件，如皂化劑濃度、皂化溫度及皂化時間等使樣品皂化完全的條件對測定結果影響很大。
7、醚液合併和過無水硫酸鈉後用石油醚洗分液漏斗3次洗液倒入有機相中，防止漏斗壁沾有待測組分。
測 定
•色譜參考條件
維生素 A、D、E 測定色譜參考條件
色譜柱： 第一維色譜柱：C8柱， 50 mm ×4.6 mm， 2.7 μm，或具同等性能的色譜柱。 第二維色譜柱：PAH柱， 100 mm ×3.5 mm， 2.1 μm，或具同等性能的色譜柱。 Trap柱：C18柱， 5 mm ×4.6 mm，4 μm，或具同等性能的色譜柱。
檢測波長：維生素A(325nm)；維生素:(294nm)；維生素D:264nm。
波長檢測方法：（0-4.5）min 325nm，（4.5-6）min 改變為294nm，5min左右切閥（時間長短0.4-0.45min）（6-15）min改變為264nm.
柱溫：35 ℃±1 ℃。
進樣量：10 μL。
時間：15min
流動相：一維:甲醇,水；二維:甲醇,乙腈
流速：一維:1ml/min；二維:0.3ml/min
維生素A D E 標準曲線的繪製
維生素標液矯正方法
注意：維生素A、D、E不穩定易分解，標準儲備液使用前需要進行校正
C——維生素ADE濃度，單位為克每毫升（g/mL）；
A——維生素A、D、E的平均紫外吸光值；
V——加入標準儲備液的量，單位為微升（μL）；
E——A、D、E維生素1 %比色光係數；維生素A：1835，維生素E：71
維生素D：462
維生素A D E 試樣的測定
維生素 A、 D、E 標準曲線的繪製
•維生素A標準工作液濃度分別為0.5μg/ml，1μg/ml，3μg/ml，5μg/ml， 8μg/ml，10μg/ml（配置於棕色容量瓶，-20℃保存3個月）。
•維生素E標準工作液濃度分別為10μg/ml，50μg/ml，80μg/ml，120μg/ml,150μg/ml，220μg/ml（配置於棕色容量瓶，-20℃保存3個月）。
•維生素D標準工作液濃度分別為0.02μg/ml，0.04μg/ml，0.08μg/ml，0.15μg/ml,0.2μg/ml，1μg/ml（配置於棕色容量瓶，-20℃保存3個月）。
•分別將維生素 A、D、 E標準工作液注入液相色譜儀中，得到峰高(或峰面積)。以峰高(或峰面積)為橫坐標，以維生素 A、 D、E 標準工作液濃度為縱坐標分別繪製維生素 A、 E標準曲線。
•維生素 A、D、 E試樣的測定，將試液注入液相色譜儀中，得到峰高(或峰面積)，根據各自標準曲線得到待測溶液中維生素A、D、 E的濃度。
注意：進樣前先試二維的準確切閥時間，保證二維切閥時間在0.4-0.45min內
維生素A D E含量的計算
維生素A的計算 XA=CA*V/m*100
維生素E的計算 XE=CE*V/m*100/1000
維生素D的計算 XD=CD*V/m*100
註：XA(ug/100g)、XE(mg/100g)、XD(ug/100g)是樣品中維生素A、D、E的含量重複性條件下獲得的三次獨立測定結果的算術平均值表示，結果A保留小數點后一位，D、E保留小數點后兩位。CA、CE、CD分別為從標準曲線得出的樣品中維生素A、D、E的濃度，V為樣品測定中最終的定容體積，m為樣品的稱量質量。
維生素A、D、E加標回收率：
維生素A的回收率是87%
維生素D的回收率103%
維生素E的回收率是97.3%