加拿大團隊開發基於NGS平台的丙型肝炎病毒基因分型及耐葯檢測

日前，英屬哥倫比亞大學（以下簡稱英屬哥大）卓越教學中心的研究人員開發了一種基於高通量測序的丙型肝炎病毒檢測方法，該方法可鑒定產生耐葯的病毒變種。研究人員表示，該檢測方法還可進行病毒分型，是PCR、雜交和基於Sanger平台檢測技術的有力補充。與傳統檢測方法，基於NGS的檢測方法具有更佳的檢測範圍及鹼基解析度。

據英屬哥倫比亞大學艾滋病毒卓越教學中心的負責人安妮塔·豪爾介紹，目前，加拿大的患者均可免費進行該檢測，但豪爾表示，她希望加拿大衛生機構最終能夠覆蓋該檢測，她估計檢測約需270美元。研究團隊正在努力組建相關的國際聯盟，並建立丙型肝炎病毒耐葯變種資料庫，以針對耐葯菌株的增加採取對策。

丙型肝炎的獨特之處在於90％至95％的長期感染者實際上是可以治癒的。然而，治療藥物比較昂貴，三個月的療程的費用高達30000~50000美元。因此，對患者採用適宜的藥物雞尾酒療法至關重要。

此外，一些患者感染了天然耐葯的病毒株，如果在開始治療之前不知道這些基因信息，那麼這些患者的治療將會以失敗告終，患者將繼續攜帶病毒，有著較高擴散耐葯丙肝病毒的風險。豪爾強調，通過實施耐葯檢測，不僅有希望將治癒率提高，還將阻止丙型肝炎耐葯株的傳播。

基於此。英屬哥大艾滋病毒卓越教學中心的研究人員開發了基因分型和耐葯檢測，對104鹼基組成的丙型肝炎病毒基因組進行完整測序。該檢測在IlluminaMiSeq平台上進行，此前研究人員已經用Sanger測序檢測對特異性耐葯突變的兩個患者隊列進行了驗證。通過檢測一個包含70位患者的隊列的特異性耐葯突變，發現了一個針對藥物Olysio（辛伐他汀）耐藥性的突變。此外，該團隊還進一步在90位採用蛋白酶和NS5A抑製劑雞尾酒療法的患者體內檢測到存在NS3/4A、NS5A和NS5B基因耐葯突變，進一步驗證了NGS檢測的準確率。

檢測能夠同時鑒定丙型肝炎病毒基因分型。豪爾說，有七種不同的丙肝病毒基因型，大多數丙肝藥物都是基因型特異的。她表示：「如果你對錯誤的基因型使用錯誤的藥物，治療失敗的可能性就會很大。」

丙型肝炎病毒基因分型的標準方法是基於實時PCR方法。基因分型檢測通常僅分析104對鹼基丙型肝炎病毒基因組的約100個鹼基對。但是，由於丙型肝炎病毒的突變率如此之高，因此有時檢測會鑒定為不正確的基因型，或者無法鑒定基因型中的特定亞型。豪爾介紹，對整個丙型肝炎病毒基因組進行測序可以改善基因分型。

對一位病人的傳統診斷檢查流程是，醫生首先進行基因分型檢測，然後根據分型信息進行耐葯檢測——只尋找與特定基因型相關的耐葯突變。所以如果基因分型檢測是錯誤的，那麼基於Sanger檢測方法的耐葯檢測也將失敗，豪爾說。但是，通過對整個丙型肝炎病毒基因組測序，可同時收集基因分型和耐葯信息。

耐葯檢測也很重要，因為有證據表明對存在耐葯突變的患者優化治療策略可以增加治療成功的可能性。例如，對於某些耐葯突變，治療周期只需要增加到12周以上。她說：「延長治療周期有助於清除病毒的殘餘部分。」

對於其他類型的耐葯突變，有證據表明，將藥物利巴韋林加入雞尾酒療法有增加治療效果的可能性。豪爾說添加利巴韋林的作用原理還不完全清楚，但是一個假說是利巴韋林有助於增強免疫系統。

對完整的丙型肝炎病毒基因組進行測序的另一個優點是，除了鑒定已知的耐葯突變外，同時也能夠鑒定潛在的新型耐葯突變。因此，研究人員也在努力開展國際合作來收集和共享數據。豪爾說，英屬哥大網站將作為構建資料庫的中樞，目前正在努力搭建IT基礎設施，並確定數據分享和隱私協議等技術細節。資料庫將能夠支持NGS測序數據以及Sanger測序數據。此外，豪爾還表示，研究團隊希望將相關知識，檢測標準流程和解讀資源輸出到其他國家，儘管她尚未制定具體的計劃。

豪爾介紹，目前在丙型肝炎病毒藥物仍高度有效時實施這樣一個方案，對確保藥物繼續以極高的比例治癒病人至關重要。5％~10％未被治癒的患者「將攜帶耐葯丙型肝炎病毒並繼續傳播病毒，只是這次是耐葯丙型肝炎病毒，而非野生型病毒，耐葯病毒感染的人數將隨著時間的推移而繼續擴大」。

參考文獻：

https://www.genomeweb.com/molecular-diagnostics/canadian-team-develops-ngs-based-hcv-genotyping-drug-resistance-assay