光遺傳，還用埋置光纖？新型近紅外無線光遺傳技術

【Science】重磅！光遺傳，還用埋置光纖？新型近紅外無線光遺傳技術

來源：和元生物技術上海股份有限公司

​2014年，《NatureMethods》雜誌在十周年之際推出了紀念特刊，點評了過去十年中對生物學研究影響最深的十大技術，光遺傳技術赫然在列。毫不誇張地說，光遺傳學給神經科學領域帶來了一場技術革命，它不僅在神經環路研究方面大放異彩，而且有極大潛力治療多種精神類疾病。現在，這一技術已經成為許多實驗室中的必需工具。

​然而，光遺傳學也有很多局限，其中之一就是腦組織損傷問題。因為可見光並不能穿透腦組織，所以在激活深部腦區時，需要埋植很長的光纖，這便帶來了組織損傷問題。為解決這一問題，科研工作者利用組織通透性最強的近紅外光（Near-infrared,NIR, 700-1400 nm），通過雙光子光遺傳學方法激活目標神經元，但是這種方法只能應用於淺層腦區研究。

​2018年2月9日，Science刊登了RIKEN腦科學研究所Thomas J.McHugh研究組的最新重要工作[1]，他們通過上轉換納米顆粒(Upconversion Nanoparticles,UCNPs)介導的無線光遺傳技術刺激大腦深部區域，通過UCNPs將近紅外光轉變為可見光，激活常見的光遺傳學通道，誘發出多巴胺釋放、癲癇終止、theta波振蕩、記憶召回等生理現象，極大推動了光遺傳學領域的發展。

​ 結 果

1.UCNPs介導近紅外光刺激大腦深部區域

首先介紹一下技術的原理。作者使用NaYF4:Yb/Tm@SiO2納米顆粒，這種顆粒可以將穿透組織的近紅外光（NIR）轉換為高能藍光（470-475nm），打開ChR2陽離子通道，進而激活神經元。不同類型的納米顆粒可以將NIR轉換為適合NpHR或Arch的各色可見光。

接下來，作者在腹側被蓋區（顱骨下~4.2 mm）注射UCNPs，並埋植光纖來記錄激發出的藍光。他們發現，顱外980nm的2.0W NIR刺激可以在VTA區域中誘導出~0.063mW/mm2強度的藍光(圖1)。在理論上，此效率足以激活ChR2。

​2.NIR激活VTA多巴胺神經元的體外驗證

在證實腹側被蓋區（Ventral Tegmental Area,VTA）的UCNPs可以將NIR轉換為藍光后，作者希望進一步考證轉換的藍光是否足以激活VTA中多巴胺神經元。他們在TH-Cre小鼠的VTA中注射AAV-DIO-ChR2-EYFP，4周后在相同位置注射NaYF4:Yb/Tm@SiO2納米顆粒，膜片鉗記錄VTA腦區多巴胺神經元。他們發現，NIR可以誘導出興奮性突觸后電流（EPSC），而且NIR強度越高，其誘發的EPSC幅度越大。除此之外，NIR也可以誘導多巴胺神經元產生動作電位（圖2）。表明NIR可以通過UCNPs體外激活VTA多巴胺神經元。

3.NIR激活VTA多巴胺神經元的在體驗證

體外驗證之後，作者希望了解NIR是否可以透過顱骨在體激活VTA多巴胺神經元。他們用了相同的方法，在TH-Cre小鼠的VTA中注射AAV-DIO-ChR2-EYFP，4周后注射NaYF4:Yb/Tm@SiO2納米顆粒。他們發現，在顱骨上方2mm處用光纖投遞1.4W/mm2的NIR刺激可以誘發VTA多巴胺神經元表達c-fos，即激活這些神經元。

接下來，作者使用快速掃描循環伏安法檢測伏隔核（NAc）腦區的多巴胺釋放量。他們發現顱外NIR刺激可以誘髮長達15秒的多巴胺釋放，而顱外藍光並不能引起多巴胺的釋放（圖3）。這些結果說明NIR可以通過UCNPs從顱外激活VTA多巴胺神經元，使這些神經元在NAc釋放多巴胺。

4.NIR光遺傳在其它神經系統的在體驗證

在體內驗證NIR光激活VTA多巴胺神經元之後，作者希望驗證NIR刺激的抑制效應，也希望在其它神經系統中進一步驗證此新技術。

首先，作者使用另一種納米顆粒——NaYF4:Yb/Er@SiO2 UCNPs，這種UCNPs可以將近紅外光轉換為~540nm的綠光。他們在CamKII-Cre小鼠的海馬注射AAV-DIO-Arch，4周后在相同位置注射NaYF4:Yb/Er@SiO2UCNPs納米顆粒，又將小鼠麻醉並注射紅藻氨酸（以誘發癲癇）。他們發現，顱外長時間低強度NIR刺激可以大幅降低海馬神經元中c-fos的表達，即抑制海馬神經元的癲癇狀態。

然後，他們又在PV-Cre小鼠的內側隔核（MS）中注射AAV-DIO-ChR2-EYFP，4周后在相同位置注射NaYF4:Yb/Tm@SiO2納米顆粒，並在海馬區域埋植電極來記錄場電位。他們發現，以theta振蕩的頻率（6-12Hz）投遞NIR刺激可誘導海馬區域產生theta振蕩，與MS腦區的生理功能相一致。

最後，作者在海馬齒狀回注射c-fos-tTA和AAV-DIO-ChR2-EYFP，4周后在相同位置注射NaYF4:Yb/Tm@SiO2納米顆粒。對於c-fos-tTA系統，只有表達c-fos（被激活）的神經元才表達Cre重組酶。他們發現，NIR刺激會激活齒狀回中參與恐懼記憶的神經元，進而顯著增加小鼠的顫慄行為（圖4）。

綜上所述，UCNPs介導的NIR無線光遺傳技術可以應用於多個神經系統，誘發多種生理現象，包括抑制癲癇、誘導theta振蕩以及召回恐懼記憶。

總 結

光遺傳技術給神經科學帶來了一場技術革命，被廣泛應用於環路研究領域，然而光遺傳操作過程中，光纖的埋植會帶來腦組織損傷問題。本篇重要文章發明了一種新型無線光遺傳技術，通過上轉換納米顆粒將組織穿透性的近紅外光轉換為對應於ChR2或Arch的藍光或綠光，體外NIR刺激可以激活或抑制目標神經元，從而誘發多種生理現象。這項技術很可能為神經科學帶來新的技術革命！

參考文獻

[1].Chen, S., et al., Near-infrared deep brain stimulation viaupconversion nanoparticle-mediated optogenetics. Science, 2018.359(6376): p. 679-684.