新葯研發有多難？看PARP抑製劑四十年開發沉浮史

非藥學專業的同學聊天，他們會問我做新葯難不難。我可以羅列一堆臨床試驗成功率數據來論證做新葯有多艱難，不過拿PARP抑製劑的研發過程來舉個例子更合適不過了。

PARP的全稱是多聚ADP核糖多聚酶，上世紀60年代就被發現，但直到80年代初期通過化學探針抑制酶活性才確定了該酶的功能。科學家們早在幾十年前就開始嘗試研發靶向PARP酶家族的藥物，之後對PARP抑製劑主要作用機制的理解則不斷深入。

科研人員最初認為PAPP抑製劑的藥效是單純的通過抑制PARP催化活性產生的，使DNA單鏈損傷無法得到修復，而DNA複製時產生的複製叉行進至PARP結合的損傷位點時，可能會引起複制叉被破壞進而引起DNA雙鏈損傷，從而引發DNA損傷反應，誘導細胞凋亡 [1]。

但最近幾年的多項研究表明，一些PARP抑製劑能夠使PARP1無法從DNA損傷位點脫離，影響PARP1酶的催化循環過程，進而影響DNA穩定性並導致細胞毒性作用 [2-4]。這種作用機制與DNA拓撲異構酶II的作用機制比較類似，該酶抑製劑的作用機制同樣是使DNA修復蛋白無法從雙鏈DNA上脫離。

依據PARP抑製劑的藥理機制，科學家們提出了PARP抑製劑在腫瘤領域的兩種臨床應用策略。

第一種策略是PARP抑製劑與化療藥物聯用治療各種類型的癌症，該策略如果成功毫無疑問將會帶來巨額的商業利潤，因此製藥公司開始投入巨額經費研究PARP抑製劑與各種化療藥物的聯用。但科研人員在研究過程中發現化療與PAPP抑製劑聯用的毒性太大，兩類藥物產生的協同作用可以產生嚴重的骨髓抑制，很難找到PAPR抑製劑與化療藥物聯用的安全藥物劑量。

另一種策略是基於合成致死（synthetic lethality）的理念。Synthetic lethality經常被翻譯為合成致死，個人認為翻譯為協同致死或者綜合致死可能更為貼切，但出於閱讀習慣考慮，本文沿用合成致死。這個策略的出發點是：單個基因突變不會對細胞生存產生明顯影響，但兩種關鍵基因損傷同時發生會導致細胞死亡。

腫瘤細胞具有兩種DNA損傷修復能力，一種是修復雙鏈DNA斷裂的同源重組 (HR) 修復，另一種是PARP參與的單鏈DNA修復。如果同時削弱腫瘤細胞的兩種DNA損傷修復機制可以誘導腫瘤細胞凋亡，這正是合成致死理念的最好詮釋。

這也意味著如果腫瘤細胞HR修復功能本身就存在問題，那麼PARP抑製劑就可以作為單葯使用。而在此之前科學家們就發現存在BRCA突變的腫瘤細胞HR修復功能會存在缺陷。2005年Nature同期發表了兩篇文章證實了存在BRCA突變的腫瘤細胞對PARP抑製劑非常敏感 [5-6]。該研究也引發了PARP抑製劑研究的第二輪熱潮。

by Jerry

與聯合化療的方案相同，合成致死策略的早期臨床研究並沒有獲得積極的療效數據，導致PARP抑製劑的兩種臨床應用之路在當時看來似乎都行不通。不過進行臨床前動物模型研究的科研人員也發現，PARP抑製劑與化療聯用和單葯使用時的作用模式存在明顯差別。小鼠實驗表明，如果PARP抑製劑聯用某種DNA損傷藥物，PARP抑製劑的給藥劑量必須非常低，而且用藥周期必須很短，否則會引起實驗動物的死亡。而如果單獨使用PARP抑製劑的話，給藥劑量必須非常高，而且必須保證足夠長的用藥周期才能抑制腫瘤的生長。

換句話說，第二種策略是單獨用藥，安全性不存在問題，理論上可行性更高。只不過科研人員最初在單獨使用PARP抑製劑時，給藥劑量是參照與化療聯用時使用的劑量，認為低劑量及短期給葯就足以發揮藥效。由於當時人們並不知道如何合理使用該類抑製劑，由此導致臨床試驗設計上存在缺陷，試驗失敗也是情理之中的事情。

I、波 折

PARP抑製劑的研發過程真可謂是一波三折，雖然對於用藥劑量問題的研究已經比較深入，但接下來的臨床開發依然十分不順利。該類藥物開發過程中最重大的挫折來源於BiPar Sciences開發的抑製劑BSI-201。2009年4月賽諾菲以大約5億美金的價格收購BiPar Sciences獲得了該葯的權益。賽諾菲當時以為自己撿了個大便宜，很快在ASCO2009大會上公布了該葯 (后更名為iniparib) 的II期臨床試驗數據，稱iniparib聯合吉西他濱和卡鉑能夠延長三陰乳腺癌患者的生存期，而且PARP抑製劑的聯用方案並沒有產生明顯安全性問題。2010年，賽諾菲又在ESMO會議上公布了該試驗的具體數據，稱該聯用方案可以使患者的生存期延長近5個月。

但接下來發生的事情卻讓賽諾菲高興不起來了。2011年初，賽諾菲宣布iniparib在一項III期試驗中無法延長三陰乳腺癌患者的生存期 。由於iniparib之前的影響力太大，該結果的公布瞬間澆滅了整個製藥行業對PARP抑製劑的開發熱情。

阿斯利康在同一時間宣布停止自己PARP抑製劑olaparib用於BRCA陽性乳腺癌患者的開發。而且在2011年末，阿斯利康宣布olaparib一項針對卵巢癌患者的II期臨床試驗失敗，選擇停止該適應症的開發。數據顯示雖然olaparib能夠延緩卵巢癌患者疾病進展，但無法延長患者生存期。

在同一時間，輝瑞將自家的rucaparib賣給了Clovis Oncology，而默克也在2012年將niraparib賣給了Tesaro。由於存在太多的不確定性，大多數製藥公司不太願意再啟動新的臨床研究。

然而，2012年拉瓦爾大學醫學中心的Kaufmann發表文章稱賽諾菲的iniparib並不是真正的PARP抑製劑 [7]。可以說這一發現讓腫瘤學家和投資人倍感欣慰，因為很早之前他們就覺得iniparib的臨床數據非常奇怪，與其他多個PARP抑製劑的動物實驗數據並不一致，而且臨床研究中iniparib聯用卡鉑和吉西他濱並不會產生明顯的骨髓抑制現象。但由於賽諾菲和BiPar當時沒有公開臨床研究過程中的的用藥劑量等關鍵數據，因此科學家們也沒有確認iniparib的體外活性。

其實Clovis Oncology在購買輝瑞的rucaparib權益之前了解到iniparib不會產生骨髓抑制作用，他們就開始懷疑iniparib不是真正的PARP抑製劑，這也可能是Clovis Oncology果斷從輝瑞購買rucaparib繼續開發的原因。

2012年末，阿斯利康在對olaparib卵巢癌II期臨床數據進一步分析之後發現，部分患者使用olaparib后確實能夠產生明顯獲益，隨即在ASCO2013大會上公布了回顧性分析結果——攜帶BRCA突變的卵巢癌患者相比不攜帶突變患者對olaparib的響應率更高，而且相比安慰劑組，攜帶突變的患者能夠使PFS（無進展生存期）延長6.9個月。更重要的是，攜帶BRCA突變並使用Olaparib的患者相比安慰劑組可使生存期延長3個月。受以上數據的鼓舞，阿斯利康2013年下半年啟動了兩項III期研究以評價olaparib單葯維持治療攜帶BRCA突變的卵巢癌患者的療效。

2014年12月21日，FDA批准olaparib上市用於既往經至少3次化療治療失敗的BRCA胚系突變晚期卵巢癌患者的治療。2016年12月19日，FDA批准Clovis的PARP抑製劑rucaparib上市，用於治療已接受兩種及以上化療方案的且存在胚系或者體細胞BRCA基因突變的晚期卵巢癌患者的治療。

儘管早期的臨床研究主要集中於對存在BRCA胚系突變的腫瘤的有效性研究上，但後來發現不攜帶該類突變的患者也能夠產生應答 [9]。其實從PARP抑製劑和合成致死的作用機制的角度很容易解釋這一現象。

PARP抑製劑可以抑制PAPR的催化循環過程，使PARP無法從已結合的DNA上脫離，由此引發DNA損傷反應 (DDR)，而BRCA1/2 參與的同源重組修復 (HRR)是DDR中最佳的DNA修復手段，能夠有效修復和重啟由於PARP抑製劑引發的複製叉行進中止。如果HRR機制存在缺陷的話將有可能產生合成致死效應，誘導腫瘤細胞凋亡。然而BRCA1/2 並不是HRR機制中唯一的重要組分，參與編碼同源重組修復通路中的其他重要蛋白的基因突變也有可能引發HRR機制缺陷，產生合成致死。因此理論上來講BRCA1/2並不是PARP抑製劑的唯一生物標誌物 (biomarker)。

最終，臨床試驗也證實了PARP抑製劑的有效性並不局限於BRCA基因突變。因此FDA在今年3月27日批准Tesaro公司的niraparib上市，用於接收鉑類藥物治療后完全應答或部分應答但又疾病複發的成人卵巢上皮癌、輸卵管癌和原發性腹膜癌患者的維持治療。8月17日，olaparib與niraparib相同的適應症獲得FDA批准。

其實PAPR抑製劑有效性超越BRCA基因突變局限性這一理念的驗證，不僅擴大了PARP抑製劑的應用範圍，也同時帶動了PARP抑製劑生物標誌物的研究以及恢復了科研人員對整個合成致死領域研究的信心。

II、合成致死的復興

當前主流的腫瘤靶向藥物的開發主要是基於原癌基因成癮性 (oncogene addiction）的機制來研發的，也就是說通過抑制腫瘤生長依賴的原癌基因或者相關通路來研發藥物。儘管這些藥物對某些類型的腫瘤有效，但並不是所有腫瘤都攜帶具有成藥性的功能獲得性原癌基因突變，這些腫瘤中攜帶的非原癌基因突變可能與其他腫瘤特異性基因突變相互作用，兩類基因同時抑制時會誘導細胞凋亡，產生合成致死效應，因此合成致死理念的應用可大範圍的擴展抗腫瘤藥物研發的潛在靶標。

但由於PARP抑製劑開發過程中的波折，尤其是iniparib烏龍事件的影響，即使在olaparib獲批上市之後，製藥行業對於基於合成致死理念的新葯研發熱情依然不高。除了iniparib的影響，該領域研究進展比較緩慢的一個非常重要的原因是缺乏高效的研究工具。

直到最近幾年，製藥公司和學術機構的研究人員一直在使用RNAi技術來尋找抗腫瘤藥物靶點，通過大批量篩選能夠抑制基因表達的siRNA/短髮夾RNA干擾文庫來篩選能夠產生合成致死作用的基因。但RNAi技術存在一個致命的缺陷：脫靶效應太強。基於RNAi技術的實驗能夠產生大量的假陽性結果，因此使靶點的驗證變得非常困難。這也是很多專註於合成致死領域研究的生物製藥公司始終沒能取得很大進展的主要原因之一。

但最近一兩年內出現了另一批專註於合成致死領域的生物製藥公司，這些公司使用的是比RNAi高效的多的研究工具: CRISPR。自從2013年CRISPR基因編輯工具誕生以來，該技術對基礎科研，農業，醫藥等領域產生了極大的影響。筆者在之前的文章里非常詳細地介紹了該技術的基礎概念，發展過程以及對多個領域的影響。通過CRISPR gRNA分子庫來尋找能夠產生合成致死相互作用基因也成了該類公司融資的基礎。

今年6月Repare首輪融資6800萬美金，這應該是2017年上半年生物製藥行業金額最大的一筆早期融資。上個月KSQ Therapeutics融資7600萬美金，部分資金將用於合成致死藥物靶點的研究。

學術機構和製藥公司的科研人員通常使用兩種基於CRISPR技術的策略來篩選合成致死藥物靶點。第一種是使用CRISPR gRNA分子庫對細胞關鍵基因逐個進行敲除，並與未進行基因敲除的細胞進行對比，尋找能夠影響細胞功能的基因。而另一種策略是使用的是包含或者不包含已知的合成致死相關基因突變 (比如BRCA基因突變) 的兩種細胞株，使用CRISPR分子庫逐個敲除兩種細胞株的基因，通過對比兩類細胞基因敲除之後的影響來篩選靶點。

以上兩種方法相比RNAi技術都能獲得更優質的藥物靶點，但在技術的具體應用過程中每個公司都各有不同。例如Tango公司首先會尋找一部分病人，並使用與每位病人基因相匹配的細胞株進行實驗，利用經過成藥性優化的CRISPR gRNA分子庫 (只篩選可能成藥的基因靶標) 來獲得藥物靶點。而KSQ則是對將近600多個細胞株的全基因組基因逐個進行敲除 (人大約有19000個基因，這種敲除效率在CRISPR出現之前是無法想象的)，從而獲得大量的基因敲除對細胞功能影響的數據。

儘管CRISPR技術極其高效，但並非完美無缺，其中最重要的一點是基因敲除與使用RNAi進行基因沉默以及通過小分子抑制蛋白功能產生的效應可能完全不同，因此如何對試驗結果進行解讀變得十分重要。而且合成致死相互作用的篩選也存在諸多問題，比如很多合成致死相互作用是條件依賴性的，在細胞環境改變之後其相互作用可能消失。

無論是CRISPR技術還是RNAi，都是通過細胞水平的功能研究來獲得藥物靶點，細胞水平的功能影響並不一定意味著能夠對整體動物或者人體中的腫瘤產生影響，即使獲得了大量的潛在藥物靶點，也必須經過繁瑣的進一步靶點驗證過程，基於靶點的藥物設計合成研究過程，以及臨床試驗研究。尋找藥物靶點只是萬里長征的第一步。

近兩年合成致死領域的生物技術公司融資情況

III、未 來

近幾年，腫瘤免疫療法的迅速發展已經對抗腫瘤領域的新葯研發產生了極大影響。幾乎每一個涉足抗腫瘤新葯領域的製藥公司都不得不去考慮現有療法如何與已上市的腫瘤免疫療法聯用。

存在BRCA1/2突變以及HRR缺陷的腫瘤通常具有更高的突變率，因此可能產生更多的新抗原 (neo-antigen)，從而引發更強烈的免疫反應。所以理論上來講，PARP抑製劑或DNA損傷抑製劑聯用PD-1或者CTLA-4抑製劑治療存在HRR缺陷的腫瘤能夠提高藥物療效/患者響應率 [9-10]。而且有研究顯示BRCA缺陷能夠引發STING依賴性的固有免疫應答，這也為PARPi/腫瘤免疫療法提供了依據 [11]。

儘管PARP抑製劑/腫瘤免疫療法聯用理論上可行，而且已有製藥公司開始進行該方面的臨床研究（例如NCT02734004，臨床1/2期，olaparib/durvalumab），但仍然需要經歷漫長的臨床研究才能確定該策略的有效性與安全性。早期PARP抑製劑/化療聯用臨床研究的失敗（化療/PARP抑製劑聯用從理論機制上講更加合理）也提醒我們不應該過度的樂觀 [12]。

國內做PARP抑製劑的製藥公司以及學術機構也非常多，進入臨床的包括百濟神州的BGB-290，恆瑞的SHR-3162等等，需要指出的是不同結構的PARP抑製劑療效和作用機制差別可能會特別大。

國內註冊申報的PARP抑製劑

來源：醫藥魔方發現

PARP抑製劑不僅能夠抑制該蛋白的活性，更重要的是能夠抑制PAPR從DNA上脫離，而不同的抑製劑這兩方面性質可能存在明顯差異。例如臨床研究中使用替莫唑胺 /veliparib聯用，理論上來說PARP抑製劑可以通過抑制PARP的DNA脫離來增強DNA烷化劑替莫唑胺的DNA損傷作用，但是由於veliparib抑制PAPR蛋白DNA脫離的作用非常弱，所以導致veliparib無法提高替莫唑胺的療效 [13]。

我的同學當中也有人在做PARP抑製劑，其實從某種層面上來講做葯化方面的研究並不是一件容易的事情，有些化合物的合成過程本身就讓人非常頭疼，經過一兩年的折騰合成出幾十個化合物之後，幾輪篩選和結構優化也難找到活性高選擇性好的小分子。即使得到活性比較好的化合物，後續的細胞水平實驗，動物模型安全性有效性實驗的過程中也存在重重障礙，ADMET性質的優化也會很讓人崩潰。

對於PARP抑製劑來說臨床研究則更加困難，從化療聯用以及2005年Nature文章[5-6] 驗證的PARP抑製劑/BRCA合成致死理念到olaparib的上市總共花費了超過10年的時間。10年之後我們才逐漸理解臨床中如何合理的應用PARP抑製劑。我們很難預計該領域未來還會遇到多少阻礙，但借用我導師的一句口頭禪——Always hope for the best.