【微生物專題培訓】土壤及根際微生物研究案例分享

土壤為複雜的生態系統，土壤微生物是土壤的重要組成部分，土壤微生物也是根系微生物的主要來源，在其中起到至關重要的作用，如參與土壤養分循環、分解有機物質、形成土壤團粒結構、傳播作物疾病和生物防治、增加土壤養分有效性進而增加植物對養分的利用、緩解逆境土壤對作物生長和生產的壓力、加強根系生長以及根部修復等。揭示土壤微生物群落結構、多樣性及其時空分佈特徵與種植方式之間的關係，對於提高土壤資源利用效率、保障土壤質量和健康以及生態系統可持續發展具有重要的理論和實踐意義。

研究目的

研究土壤類型和大豆基因型對根際微生物的影響，鑒定與土壤和宿主基因型相關的的有益微生物和功能。

材料與方法

1.為研究土壤類型對根際微生物的影響，取兩份不同來源的土壤（ADE：土壤肥沃和高微生物多樣性和AGR：氧化土，已用於農業實驗種植大豆和玉米），取400g，分為三份，分別測量理化性質（ph,鋁，鈣，鎂，鐵，銅，鋅，氨，氮等）；

2.用第一步收集的兩種類型土壤在陶瓷盆中（包括8kg土壤）種植四種不同品種的大豆（不同水平的尖孢鐮刀菌的抗性：從具有抗性到易感），每盆四顆種子，每種類型實驗3個生物學重複；在實驗生態系統中模擬最優的生長環境，在初花期收集根際土壤；

3.去除根際附著不緊密的土壤，然後使用無菌的刷子收集附著緊密的土壤。共得到30個樣品（原始土壤2x3個+2種土壤x4個大豆品種x3個重複）；

4.qPCR用於定量土壤和根際微生物基因的拷貝數，使用循環閾值（CT）評估每個樣品中模板DNA的數量；

5.微生物多樣性V3-V4測序+宏基因組測序（流程圖如下）。

分析結果

1.通過豐富度（shannon）和多樣性(Faith』s PD)指標的評估，抗性品種根際具有更高的物種多樣性。生長在ADE土壤中的微生物具有更高的丰度（基因拷貝數多），並且隨著易感性的增加而逐漸減少。抗性根際中發現的較高的細菌含量可能會導致資源競爭的加劇並有助於提升對真菌感染的防禦。

2.通過微生物多樣性和宏基因組結果，一致發現了在科水平Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Cytophagaceae ,Solibacteraceae在抗性品種根際具有較高的丰度。在ADE土壤中，Pseudomonas 和Bacillus具有較高的丰度，這兩個屬已知具有促進根系生長，根際修復，抑制非生物脅迫和植物病害的功能。

3.基於物種註釋結果與理化因子的RDA分析發現，大豆根際中細菌群落的分類學組成和土壤不同，例證了根際效應（根際微生物區系因受根系選擇影響,組成的種類比非根際多,且各類群之間的比例也與非根際有很大差異）；在ADE土壤中，大豆品種間的分類學差異更明顯，其根際群落結構與品種間存在顯著差異。通過功能組成與理化因子的RDA分析表明，基於微生物功能很難區分四個不同的品種。隨後，通過蒙特卡洛置換試驗，發現根莖群落的結構與磷含量、有機質、Cu、總氮等理化性質有關，這些參數在ADE和AGR之間存在明顯差異。

4.為了進一步研究病原菌抗性與根際微生物之間的相關性，著重研究了IAC Milenio（抗性最高）和IAC Alvorada（抗性最低，易感）組。PCA分析表明二者之間具有顯著的差異。

5.通過宏基因功能分析，在ADE土壤中，與易感品種根際相比，抗性品種中參與吩嗪和鼠李糖脂生物合成的基因的丰度較高，吩嗪抗生素在不同的作物中是抑制鐮刀菌的關鍵角色；鼠李糖脂也具有抗生素特性，對鐮刀菌也有抵製作用。在抗性品種的根際群落中，ABC轉運蛋白和蛋白質分泌系統的序列含量較高，其中一些功能與各種毒性因子的分泌有關，如抗生素、細菌素、毒素等。根據以上研究結果推測除了植物本身遺傳特性之外，抗病品種能夠通過更好地吸收有益的微生物群，補充植物防禦病原體感染的能力。

6.根據屬水平物種丰度數據，計算微生物之間的相關性並構建網路圖，基於網路拓撲學性質比較不同樣本間的差異。抗性品種根際微生物具有最高的複雜度和模塊結構，易感品種根際微生物具有低的複雜度和模塊性，抗性品種根際微生物相關性網路具有較高的度與較低的路徑長度和直徑。以上結果說明抗性品種根際微生物相關性網路具有較高的聯通性，能夠迅速響應外界環境的擾動和有效的降低真菌侵染的成功率。

小結

儘管對大豆對鐮刀菌的抗性來自於植物遺傳，但是研究數據也說明的抗性品種根際也改變了根際微生物的組成和功能，使有益菌和有益功能的比例增加，改善的植物生長和提高了病原菌的防禦能力。

參考文獻

Influence of resistance breeding in common bean on rhizosphere microbiome composition and function. ISME J. 2017 Oct 13