工業廢水生物硝化分析

污水處理廠廣泛採用生物脫氮技術，因為硝化細菌對許多環境因素比較敏感(如pH、 溫度、 溶解氧濃度等)，所以脫氮過程中的硝化作用被認為是整個脫氮過程的限速步驟. 硝化過程中氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)將氨氮(NH4+-N) 轉化為亞硝酸鹽氮(NO2--N)，然後亞硝酸鹽氧化細菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)將亞硝酸鹽氮(NO2--N)轉化為硝酸鹽氮(NO3--N). 污水中的氨氮以遊離氨(NH3)和銨根離子(NH4+)的形式存在，遊離氨(free ammonia，FA)是AOB菌群生長所需要的初始基質，但是過高的FA會對其產生毒害作用，影響AOB和NOB菌群的生長. 王淑瑩等研究了高濃度FA對絮狀污泥和好氧顆粒污泥的抑制影響，發現氨氧化菌均勻分佈的絮狀污泥容易受到FA抑制. Chen等在富集高效硝化菌的過程中發現當FA濃度增加到10~20 mg·L-1(混合反應器)，FA對反應器的脫氮性能造成明顯的抑制. 尤永軍在SBR反應器中研究FA對硝化菌的影響時，指出隨FA濃度提高，AOB活性逐漸增大而NOB活性先增大后被抑制. 彭趙旭等研究了在活性污泥系統中(序批式活性污泥反應器，SBR)，當進水NH4+-N為65 mg·L-1時[混合液懸浮固體濃度(mixed liquid suspended solids，MLSS)為2 200~2 400 mg·L-1]，反應器硝化效果明顯變差，NH4+-N衝擊負荷對硝化作用造成短期抑制. 目前已有的研究主要集中在FA濃度對硝化性能和活性的短期抑制影響方面，或是以亞硝酸鹽積累為目的短程硝化作用影響的研究，例如孫洪偉等充分利用較高FA對NOB的抑制，通過優化DO、 ORP、 pH等參數，準確實現短程硝化. 但對生物系統反覆受到高濃度氨氮廢水的急性衝擊負荷(以下稱「衝擊負荷」)，以及完整的生物硝化反應的抑制與活性恢復機制的研究還不夠. 在連續運行模式下，不同FA濃度對硝化作用衝擊的濃度特點、 抑製程度、 持續時間、 微生物菌群變化等相關信息還缺乏報道.

本文採用SBR反應器處理模擬高濃度氨氮污水，研究高氨氮廢水衝擊負荷條件下，FA對生物硝化作用的抑制和細菌活性恢復的影響、 硝化菌群(AOB和NOB菌群)結構的變化，以揭示高濃度FA對生物硝化過程的影響機制.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗所採用的SBR反應器試驗系統如圖 1所示，SBR反應器有效容積5 L，總高0.85 m. 反應器依靠保溫水層維持溫度在25℃±0.5℃; 底部曝氣，控制反應器內溶解氧(dissolved oxygen，DO)≥2 mg·L-1. SBR反應器自動運行，每個周期6 h(進水5 min，曝氣4 h，靜沉75 min，排水10 min，靜置30 min)，每周期出水量為2.5 L. 定期排泥，控制MLSS為6 000 mg·L-1左右，污泥齡約為10 d.

圖 1 SBR反應器試驗系統示意

1.2 試驗材料

SBR反應器進水採用模擬生活污水，利用無水葡萄糖配置進水並控制化學需氧量(COD)為250 mg·L-1，利用氯化銨配置進水NH4+-N為50 mg·L-1，pH為7.8左右，具體組分為(mg·L-1)：無水葡萄糖240，NH4Cl 320，KH2PO4 30，NaHCO3 350，MgSO4·7H2O 20，FeSO4·7H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 0.25，CaCl2·2H2O 10，CoCl2·6H2O 0.000 05，MoO3 0.001 5.

1.3 試驗方法

從天津某城市污水廠曝氣池取得接種活性污泥，用2 mm孔徑的濾網去除污泥中的雜質，然後放入SBR反應器進行馴化培養. 在進水氨氮濃度為50 mg·L-1條件下，運行SBR反應器，待出水NH4+-N穩定至0.2 mg·L-1以下時，開始進行衝擊負荷試驗. 衝擊負荷試驗中，SBR的進水NH4+-N濃度逐漸提高到150、 200、 300、 400、 500、 750、 1 000、 1 250、 1 500、 2 000 mg·L-1，每一個衝擊負荷運行一個周期，然後進水NH4+-N立刻恢復到50 mg·L-1進行自然恢復過程，試驗中NH4+-N穩定至0.2 mg·L-1以下所需的自然恢復時間分別為 2、 3、 4、 5、 6、 7、 9、 9、 9、 12個周期. 在衝擊負荷周期中取曝氣5 min、 1 h、 2 h、 3 h、 4 h時的活性污泥混合樣以及靜沉后的出水(定義為第6 h樣品)，經0.45 μm濾膜過濾后檢測NH4+-N、 NO2--N、 NO3--N等指標. 在衝擊負荷周期曝氣4 h時取活性污泥混合液進行比耗氧速率(SOUR)和熒光原位雜交(FISH)分析.

1.4 生物活性的表徵

AOB、 NOB及異養菌的活性分別用氨氧化比耗氧速率(氨氧化SOUR)、 亞硝酸鹽氮氧化比耗氧速率(硝化SOUR)和碳氧化比耗氧速率(碳氧化SOUR)來表徵. 通過添加不同濃度的抑制選擇劑[氯酸鈉(NaClO3)和丙烯基硫脲(ATU)]，可以測出氨氧化、 亞硝酸鹽氮氧化和碳氧化比耗氧速率.

1.5 其它分析方法

COD：密封消解和哈希COD測定儀測定; NH4+-N：納氏試劑分光光度法; NO3--N：酚二磺酸分光光度度法; NO2--N：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度度法; MLSS：重量法; DO和pH：儀器測定; SOUR：參見文獻; FISH：樣品固定和雜交方法依據標準雜交培育方法，用兩種寡核苷酸探針NSO1225和Ntspa662分別標記AOB菌和NOB菌，並用OLYMPUS IX71(Olympus，Japan)熒光顯微鏡觀察已製備好的玻片，分析雜交結果.

1.6 遊離氨的濃度

由於NH3與NH4+-N之間存在著電離平衡，因此進水FA的濃度與進水NH4+-N、 pH以及溫度有著密切的關係，見式(1)和式(2)所示：

式中，FA為遊離氨濃度(mg·L-1); TAN為總氨氮濃度(mg·L-1); Kb 為與溫度有關的氨電離常數; Kw 為與溫度有關的水電離常數.

在衝擊負荷試驗中，當進水NH4+-N濃度為：150、 200、 300、 400、 500、 750、 1 000、 1 250、 1 500和2 000 mg·L-1時的pH分別為7.72、 7.44、 7.33、 7.32、 7.27、 7.19、 7.15、 7.10、 7.04和6.98(維持在中性左右)，依上述公式計算得到，衝擊負荷進水FA的濃度分別為：4.5、 3.6、 4.1、 5.0、 5.4、 6.6、 8.1、 9.3、 10.5和11.8 mg·L-1.

1.7 抑制率計算

本文採用氨氮的最大比降解速率抑制率(IPA)和硝酸鹽氮的最大比生成速率抑制率(IPN)表徵FA分別對AOB和NOB的抑製程度，如公式(3)和(4)所示：

式中，qmax0為 FA衝擊負荷試驗中最大的氨氮最大比降解速率(以N/MLSS計，下同)，本試驗中，qmax0=12.73 mg·(g·h)-1; qmaxi為FA衝擊負荷試驗中，不同FA對應的氨氮最大比降解速率; μmax0為FA衝擊負荷試驗中最大的硝酸鹽氮最大比生成速率(以NO3--N/MLSS計，下同)，本試驗中，μmax0=4.26 mg·(g·h)-1; μmaxi為FA衝擊負荷試驗中的硝酸鹽氮最大比生成速率.

2 結果與討論

2.1 馴化污泥的活性表徵

馴化階段進水NH4+-N濃度範圍為49.5~55.1 mg·L-1，出水NH4+-N均低於0.2 mg·L-1，NH4+-N去除率可達99.7% 以上，說明反應器中硝化細菌活性很高. 進水COD為250 mg·L-1左右，馴化期間出水COD可降至20 mg·L-1以下，COD去除率在91.6% 以上. 出水pH穩定在7.2~7.5的範圍內. 圖 2顯示一個曝氣周期中氮的形態轉化，從中可知，在曝氣的前4 h，NH4+-N濃度逐漸降低到0.01 mg·L-1，同時出水NO3--N濃度逐漸增加，最後穩定在32.3 mg·L-1左右，氨氮最大比降解速率為1.38 mg·(g·h)-1. NO2--N從曝氣開始濃度逐漸增加，在1 h左右達到最大值16.0 mg·L-1，隨後逐漸降低，曝氣4 h后NO2--N低於檢出限. 通過氮平衡的計算，88.6%的NH4+-N轉化成了NO3--N，其它部分的NH4+-N可能是通過細菌的合成代謝被轉化為有機氮.

圖 2 SBR典型曝氣周期中氮的形態轉化

因為SBR系統的活性污泥中存在大量的異養菌，異養菌會利用一部分NH4+-N進行自身合成代謝，因此進水NH4+-N的去除是由異養菌和硝化細菌共同來完成的. 在一定的DO和鹼度條件下，異養菌能夠利用有機物和NH4+-N進行合成代謝[根據合成代謝公式(5)，本試驗馴化過程中進水葡萄糖濃度約為250 mg·L-1，出水COD為20 mg·L-1左右，則理論上異養菌合成代謝消耗的NH4+-N量為15.3 mg·L-1，接近實際進水和出水中總無機氮濃度之差，即20.0 mg·L-1，剩餘誤差可能是由於SBR中存在反硝化等反應造成的.

2.2 氨氮衝擊負荷對硝化作用的影響

在衝擊負荷試驗中，SBR反應器的進水NH4+-N濃度逐漸升高[圖 3(a)]，每一個衝擊負荷運行一個周期，然後進水NH4+-N立刻恢復到50 mg·L-1進行自然恢復過程[圖 3(a)]. 當NH4+-N衝擊負荷為150 mg·L-1(FA=4.5 mg·L-1)時，在第一個周期運行結束時，出水NH4+-N濃度為26.6 mg·L-1[圖 3(b)]，說明在這個NH4+-N濃度下系統內的AOB菌群已經不能對進水的NH4+-N進行全部去除，經過2個恢復周期，出水NH4+-N才降至0.2 mg·L-1以下水平. 隨著NH4+-N濃度的增加，短時出水NH4+-N濃度也逐漸增加，且出水NH4+-N恢復至0.2 mg·L-1以下所需的周期逐漸增加，當 NH4+-N衝擊負荷為2 000 mg·L-1(FA=3.6 mg·L-1)時，需要12個周期才能完全恢復[圖 3(b)]. 可見進水氨氮濃度越大，其短時去除率越低，出水NH4+-N降至0.2 mg·L-1以下的恢復時間越長. 雖然恢復時間增加了，但是FA 對AOB和NOB的抑制作用在試驗濃度下是可恢復的[24]，且硝化菌的活性並不能被完全抑制. 張亮等指出FA對硝化菌的抑制都是可逆的，硝化菌受FA抑制解除后，可逐漸恢復正常活性，且硝化菌對遊離氨的抑制存在適應性，長期高遊離氨環境下的硝化菌活性也可能逐漸恢復. 相比於重金屬類污染物(反應器相同)對活性污泥系統的毒性抑制作用，FA衝擊負荷對活性污泥的恢復速度相對較快.

圖 3 NH4+-N抑制及其恢復階段的運行效果

在150~500 mg·L-1 的NH4+-N衝擊負荷試驗中(即進水FA濃度為3.6~5.4 mg·L-1)，出水中幾乎沒有NO2--N的積累[圖 3(c)]，而當NH4+-N投加濃度大於500 mg·L-1(即FA濃度大於5.4 mg·L-1)，出水NO2--N出現明顯的積累，最大積累量為2.4 mg·L-1. 當NH4+-N大於750 mg·L-1(即FA濃度大於6.6 mg·L-1)的衝擊負荷結束時，出水NO2--N濃度分別為3.9、 26.3、 17.0、 24.3和38.4 mg·L-1，說明NH4+-N衝擊濃度大於等於750 mg·L-1(FA濃度6.6 mg·L-1)時，NOB開始受到FA的抑制. 並且，從圖 3可以明顯看出，NOB相對於AOB較易受FA衝擊負荷的影響.

2.3 FA衝擊負荷對硝化速率的影響

根據各個衝擊負荷曝氣階段的NH4+-N、 NO2--N和NO3--N濃度變化，得到不同FA衝擊負荷下氨氮去除量[圖 4(a)]和氨氮最大比降解速率[圖 4(b)]. 隨著進水FA濃度的增加，SBR反應器對NH4+-N去除量以及氨氮最大比降解速率呈現先升高后降低的趨勢，當FA濃度為9.3 mg·L-1時，NH4+-N去除量最大為156.5 mg·L-1，是馴化階段NH4+-N去除量的3.4倍; FA濃度增加至11.8 mg·L-1時，NH4+-N去除量又下降至113.0 mg·L-1，說明3.6~9.3 mg·L-1的FA促進AOB菌群對NH4+-N的去除，而FA濃度大於9.3 mg·L-1時抑制AOB菌群對NH4+-N的去除.

圖 4 SBR系統不同FA衝擊負荷下氨氮去除與硝酸鹽氮生成速率

出水NO2--N的濃度也隨著FA的增加逐漸增大. FA濃度低於6.6 mg·L-1時，系統中NO2--N濃度較低，最高濃度為1.2 mg·L-1; 當FA增加至11.8 mg·L-1時，系統中NO2--N發生明顯積累，出水NO2--N濃度達到38.4 mg·L-1，說明NOB菌群受到FA的嚴重抑制，NO2--N積累量增加了96.5%，與Chen等在活性污泥反應器(CSTR)的試驗得到的FA在11.3 mg·L-1時，NO2--N積累量增加了93.8% 相近. 試驗出水NO3--N的濃度以及硝酸鹽氮最大比生成速率呈現先升高后降低的變化趨勢，與NH4+-N去除量的變化趨勢相一致，且硝酸鹽氮最大比生成速率的最大值出現在FA濃度為10.5 mg·L-1時，為4.26 mg·(g·h)-1. 當FA為11.8 mg·L-1時，硝酸鹽氮最大比生成速率降至1.73 mg·(g·h)-1，NO3--N生成量的降低反映了FA對NOB菌群的抑制作用. Chung等發現在FA逐漸升高到10 mg·L-1時氨氮比降解速率逐漸增至最大，大於10 mg·L-1時氨氮比降解速率開始降低; FA為5 mg·L-1 時亞硝酸氧化作用的速率達到最大，隨後降低，該研究的峰值與本文的研究結論相似.

隨著FA濃度的增大，氨氮的最大比降解速率的抑制率IPA=80.70%，硝酸鹽氮的最大比生成速率的抑制率IPN=59.46%，IPA大於IPN，說明NOB比AOB菌群更敏感，更易受到高濃度FA的抑制作用.

2.4 FA衝擊負荷對SOUR的影響

圖 5顯示了FA衝擊周期內曝氣階段的亞硝化SOUR(表徵AOB菌群的活性)、 硝化SOUR(表徵NOB菌群的活性)和碳氧化SOUR(表徵異養菌的活性). 隨著進水FA濃度從3.6 mg·L-1增加到8.1 mg·L-1，亞硝化SOUR呈現增加的趨勢. FA濃度為8.1 mg·L-1時，亞硝化SOUR達到最大，即0.20 mg·(g·min)-1(以O2/MLSS計，下同)，之後隨著FA濃度的繼續升高(大於8.1 mg·L-1)，亞硝化SOUR急劇下降至0.06 mg·(g·min)-1，FA對亞硝化SOUR的抑制率為70%. 此抑制結果與前述最大比降解速率的峰值結果一致(圖 4). 硝化SOUR的變化趨勢與亞硝化SOUR的變化趨勢相同，當FA濃度為6.6 mg·L-1時，硝化SOUR達到最大值0.40 mg·(g·min)-1(以O2/MLSS計，下同)，隨後硝化SOUR急劇降低至0.10 mg·(g·min)-1，FA對硝化SOUR的抑制率達到75%. 亞硝化SOUR比硝化SOUR達到峰值時的FA濃度高，說明AOB比NOB菌群抗FA抑制的能力更強. 此外，FA對異養菌的SOUR基本沒有太明顯的影響，表明FA衝擊負荷對異養菌的活性沒有明顯的抑制作用.

圖 5 不同FA衝擊負荷下系統微生物活性的變化

氨氮既是作為基質被微生物利用，也是作為去除標準來評價衝擊負荷對硝化作用的影響，隨著進水FA濃度從3.6 mg·L-1增加到8.1 mg·L-1，氨氮的去除率雖然降低並且恢復時間增加[圖 3(b)]，但亞硝化SOUR呈現上升的趨勢(圖 5)，即AOB菌群的活性不斷升高. 系統受該濃度範圍的FA衝擊負荷后，出水氨氮出現積累，可見進水氨氮並不能完全被微生物代謝利用，說明氨氮投加量大於硝化菌自身代謝的量，才會出現出水氨氮的積累. 當進水氨氮濃度繼續提高時才會對硝化菌活性造成活性抑制作用(圖 5). 尤永軍[10]在SBR反應器中研究FA濃度(0.5、 5、 10 mg·L-1)對硝化菌的影響時，指出隨FA濃度提高，AOB活性逐漸增大，NOB活性先增大后被抑制(10 mg·L-1). 由此可見，FA抑制條件行下，系統氨氮去除率的下降並不一定表示菌群活性的降低.

2.5 FISH結果分析

本試驗在同一個反應器中經過連續的不同負荷的衝擊及其恢復過程的運行(161周期)，活性污泥中的硝化菌群有足夠時間發生變化. 因此，對馴化后以及衝擊負荷曝氣4 h的活性污泥混合液進行FISH分析觀察菌群分佈的變化特徵，用熒光顯微鏡觀察已製備好的玻片，得到泥樣中總細菌、 AOB和NOB細菌的分佈比例(圖 6和圖 7). 觀察發現，馴化后的原污泥樣中AOB和NOB菌群所佔比例分別為13.7%和9.0%(圖 6)，進水受到3.6 mg·L-1的FA衝擊負荷后，AOB和NOB菌群所佔比例分別為14.5%和9.7%(圖 7). 對不同衝擊負荷結束后的FISH圖進行數據化分析(圖 8)，結果表明，在FA的濃度小於8.1 mg·L-1時，隨著進水FA濃度不斷升高，衝擊負荷結束后AOB菌群的數量相對於前一個衝擊負荷有略微升高的趨勢，在FA的濃度大於 8.1 mg·L-1時，衝擊負荷結束后AOB菌群的數量相對於前一個衝擊負荷有略微下降的趨勢，在11.8 mg·L-1衝擊負荷結束時，AOB菌群數量降至最低. NOB菌群的數量也有相同趨勢(FA濃度在3.6~5.4 mg·L-1階段增加，大於5.4 mg·L-1開始降低，圖 8). 當FA衝擊負荷的濃度小於5.4 mg·L-1時，不同衝擊負荷結束后，AOB菌群的丰度基本保持不變，但是AOB菌群的活性升高(圖 5 中硝化SOUR)，NH4+-N的去除量也在不斷增加，說明這個範圍內的FA濃度提高了AOB菌群的活性，而對AOB菌群的丰度並沒有太大影響; 在FA衝擊負荷為5.4~8.1 mg·L-1的範圍時，AOB菌群的丰度和活性均有上升趨勢，說明這個濃度範圍的FA不僅增強AOB菌群的活性，而且可以促進AOB菌群的繁殖; 當FA濃度大於8.1 mg·L-1時，AOB菌群受到了明顯的抑制，丰度逐漸下降，且NH4+-N的去除量明顯下降，表明了高濃度FA對AOB菌群造成了毒害作用. Villaverde等的研究中，在生物過濾裝置中，利用較低的不同濃度的FA對硝化菌進行馴化，發現硝化菌對不同濃度的FA有很好的適應性，可能是由於硝化菌的逐漸增殖或者是硝化菌本身的活性增加. 在整個FA衝擊負荷過程中，AOB菌群始終是優勢菌群(圖 8)，且AOB和NOB菌群的比例基本不變，這與彭趙旭等提出的氨氮衝擊負荷對硝化作用的短期影響中，AOB和NOB菌群比例不變的發現相一致.

圖 6 原泥樣中硝化菌群FISH圖片

圖 7 FA衝擊負荷下(3.6 mg·L-1)硝化菌群FISH圖片

本試驗中將生物硝化過程(氨氧化過程和亞硝酸鹽氮氧化過程)開始受FA抑制的濃度定義為臨界抑制濃度，用來表徵AOB和NOB菌群等硝化菌群對不同進水條件下的高濃度FA的耐受性. 臨界抑制濃度由菌群丰度變化(FISH)以及活性變化(SOUR)共同決定. 當FA小於等於臨界抑制濃度時，FA對硝化細菌的硝化能力有一定促進作用; 反之，當FA大於臨界抑制濃度時，FA開始對硝化細菌活性和丰度造成抑制作用. 在試驗的衝擊負荷條件下，AOB菌群的FA臨界抑制濃度為8.1 mg·L-1，而NOB菌群的FA臨界抑制濃度為6.6 mg·L-1，說明NOB 比 AOB 菌群對FA衝擊負荷影響更敏感，更易受到抑制作用.

圖 8 不同FA衝擊負荷下AOB和NOB菌群分佈比例

3 結論

(1) 本試驗表明FA衝擊負荷在小於8.1 mg·L-1的範圍內時，增加FA負荷能夠促進硝化活性，而當FA衝擊負荷大於8.1 mg·L-1時，會對硝化作用造成抑制. AOB和NOB菌群活性的增強，體現在菌群數量增加和比耗氧速率SOUR增加; AOB和NOB菌群活性減弱，體現在菌群數量減少和比耗氧速率SOUR降低.

(2) FA的衝擊負荷不改變AOB和NOB菌群的菌群比例，AOB和NOB菌群的丰度在進水FA濃度為3.6~8.1 mg·L-1時都略微升高，當FA濃度大於8.1 mg·L-1時都會受到抑制，菌群丰度明顯降低.

(3) FA對硝化作用的抑制體現在對AOB和NOB菌群的丰度和活性(SOUR)的共同抑制，且菌群丰度和活性受抑制的變化趨勢基本一致; 氨氮去除率的變化與菌群的活性變化情況並不一致，當基質遠遠過量時，活性的提高仍然不能避免基質去除率的降低.

(4) FA衝擊負荷對硝化作用的抑制作用是可恢復的，硝化菌活性恢復時間隨著FA濃度的升高而延長. 較低濃度時(FA=3.6 mg·L-1)，2個周期即可恢復，較高濃度時(FA=11.8 mg·L-1)，則需要12個周期才能恢復.

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