「雲項目文章」關於抗生素心肌中毒，你可能不知道的那些事兒

首先咱們來做個小測試，假設您現在的身體處於一種感冒狀態，你會做出那種選擇？

A:多喝水，多運動

B:去藥店買點感冒藥吃

C:去醫院挂號就診，按照處方拿葯

如果感冒不是特別嚴重，相信大多數人都會在A和B之間選擇，除了自己扛，就是去藥店買點感冒藥，而很多時候為了感冒早點好，會不由自主選擇抗生素類葯。抗生素早已是家喻戶曉，人盡皆知了。從1929年弗萊明發現青霉素，到1942年青霉素的大規模商用以來，抗生素類藥物的出現幫助人類或動物攻克了很多疾病問題，比如肺結核、炭疽病、雞球蟲病等，不得不說抗生素是大家健康的守護者。近日，南京農業大學的高修歌老師課題組通過轉錄組測序結合百邁客雲平台分析等方法研究了一種抗生素（馬杜黴素）誘導心肌損傷的分子機制。文章發表在《Archives of Toxicology》上，影響因子5.9以上。文章題目：Transcriptome profile analysis reveals cardiotoxicity of maduramicin in primary chicken myocardial cells.

研究背景

馬杜黴素是從真菌Actinomadura rubra中分離出的有效離子載體抗生素，主要用於控制雞肉中的雞球蟲病。但是由於其安全範圍相對較窄，在農場動物和人類中已經報道了許多馬杜黴素中毒的事件。在大多數的報道中指出，馬杜黴素和其他離子載體損傷的靶器官主要是心臟和骨骼肌。但是，迄今為止，馬杜黴素誘導的心臟毒性的機制在雞和其他動物中仍不清楚。該研究探索了馬杜黴素誘導心肌損傷的分子機制，對馬杜黴素在原代雞心肌細胞中的毒性有更系統的了解，這將有助於進一步探索馬杜黴素的毒理機制，以及為馬杜黴素解毒研究做了較好的鋪墊。

材料和方法

取13-14日齡無特定病原體（SPF）雞胚胎的心室分離原代雞心肌細胞，用5μg/ mL馬杜黴素處理24小時后收集雞心肌細胞，使用0.1％二甲基亞碸（DMSO）處理的細胞作為對照。對照組和實驗組分別進行三個樣品重複，共6個樣。

測序平台：百邁客Illumina HiSeq 4000平台

分析平台：百邁客雲平台（BMKCloud）

研究結果

1.馬杜黴素對雞心肌細胞活力的影響

該研究首先通過不同濃度的馬杜黴素和不同處理時間進行CCK-8測定和分析，選用5μg/ mL計量馬杜黴素處理24小時的雞心肌細胞用於RNA-Seq研究。

2.RNA-Seq數據和差異表達基因（DEGs）的鑒定

本研究對馬杜黴素處理組（M_1,2,3）和對照組（C_1,2,3）的6個樣本，進行轉錄組測序。質控后每個樣品得到約49.7M高質量的clean reads，Q30均在85%以上，且 61.49–72.59%能比對到參考基因組上（表1）。共有1442個轉錄本差異表達，其中810個基因上調，632個基因下調。

表1.實驗組和對照組RNA-Seq測序數據

3.差異表達基因的GO和KEGG分析

對差異表達基因進行GO分析，收集前20個顯著富集的GO terms（圖1）。在細胞組成的類別中，主要條目有「胞液」 「細胞質」「細胞質的核周區」和「核仁」。 在生物過程類別中，主要條目是「高爾基體逆行運輸」，「藥物反應」和「細胞壓力反應」。差異表達基因分子功能類別中主要與「ATP結合」，「蛋白質結合」和「轉錄共激活劑活性」有關。

圖1. 馬杜黴素處理細胞中DEGs富集最豐富的GO terms

為了鑒定馬杜黴素處理的雞心肌細胞中所有差異表達基因的功能，使用KEGG資料庫對差異表達基因的路徑進行註釋。結果顯示共126個通路， 圖2展示了前50條通路，其中最顯著富集的途徑是類固醇生物合成（ko00100）、細胞因子—細胞因子受體相互作用（ko04060）、MAPK信號通路（ko04010）、toll—like受體信號通路 （ko04020）、GnRH信號通路(ko04912)、細胞凋亡(ko04210)以及一些有趣的items，包括鈣離子信號通路(ko04020)、p53信號通路（ko04115）、細胞周期（ko04110）、PPAR信號通路（ko03320）、吞噬體（ko04145）和內吞作用（ko04144）。

圖2. 馬杜黴素處理的心肌細胞中DEGs的KEGG分析

4.RT-qPCR實驗驗證差異表達基因

為了驗證RNA-Seq數據的可靠性，隨機選取19個基因進行RT-qPCR實驗。結果顯示所選的19個基因的表達水平與差異表達基因分析結果一致，表明RNA-Seq分析的準確度高。

5.雞心肌細胞毒性相關的關鍵差異表達基因

在由RNA-Seq分析鑒定的所有DEG中，細胞因子—細胞因子受體相互作用，細胞凋亡，鈣信號和細胞質空泡化是與馬杜黴素誘導的細胞毒性密切相關的關鍵代謝途徑。根據GO和KEGG的分析結果，細胞因子—細胞因子受體相互作用是馬杜黴素處理過程中變化最大的路徑。 在這些與細胞因子—細胞因子受體相互作用有關的差異表達基因中幾種典型的促炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-8屬於上調的差異表達基因中。

細胞凋亡是KEGG分析中的重要途徑。 該研究中，細胞凋亡相關差異表達基因中，編碼屬於半胱天冬酶家族的凋亡執行蛋白的CASP3被上調錶達，而屬於Bcl-2家族的BOK和BAG2下調。 更重要的是，大多數p53信號相關基因上調。結果表明，這些基因的調節對介導馬杜黴素的細胞毒性是至關重要的。

研究結果顯示，通過馬杜黴素處理后，顯著上調的基因有KCNA2、CHAC1、CACFD1、KCNJ4、KCNK1、SLC24A4和SLC4A4，而顯著下調的基因有KCNK2、SLC6A4、ABCA8、KCNG3、CNN2、CAPN5、KCNJ8和KCNQ3，說明馬杜黴素能改變雞心肌細胞的細胞內離子。 另一方面，參與液泡形成途徑的差異表達基因顯著富集。 這些液泡形成相關基因提示馬杜黴素處理期間可能有空泡形成。

6.馬杜黴素增強炎症反應

ELISA法測定TNF-α、IL-8、IL-18、IFN-γ等促炎性細胞因子的濃度，以驗證炎症反應相關的差異表達基因的功能。 結果顯示，馬杜黴素處理的細胞中TNF-α和IL-8的濃度均顯著高於對照組（P <0.05）。 但是，馬杜黴素對IL-18和IFN-γ的濃度沒有影響（圖3）。 TNF-α和IL-8水平升高表明促炎性細胞因子的增加可能是馬杜黴素中毒引起。

圖3. 不同濃度的馬杜黴素處理雞心肌細胞24小時，雞心肌細胞上清中TNF-α，IL-8，IL-18和

7.馬杜黴素誘導的細胞凋亡

如圖4a，b所示，馬杜黴素處理后，細胞凋亡率呈劑量依賴性升高。 Western blot結果顯示，馬杜黴素處理24小時后裂解半胱天冬酶-3的表達增加（圖4c，d），表明馬杜黴素激活了凋亡途徑。 這些結果與RNA-Seq分析中的上調凋亡基因一致，明確了馬杜黴素誘導的雞心肌細胞凋亡的劑量。

圖4. 馬杜黴素誘導的雞心肌細胞凋亡

8.馬杜黴素干擾細胞內鈣穩態

為了進一步證實馬杜黴素對鈣信號的影響，在馬杜黴素處理24小時後進行流式細胞術和比色法分析。 結果顯示Fluo 3的熒光增強，表明細胞內鈣水平與對照相比顯著升高（圖5a，b）。 此外，馬杜黴素處理后，Ca 2+ -ATPase活性呈劑量依賴性增加，而Na + -K + -ATPase活性並沒有呈劑量依賴性增加（圖5c，d）。 總之，這些數據表明馬杜黴素干擾了細胞內鈣離子穩態。

圖5. 馬杜黴素干擾雞心肌細胞的離子平衡

9.馬杜黴素導致細胞質中大量空泡

除了RNA-Seq和生物信息學分析方法，研究人員還進行了馬杜黴素誘導中毒的空泡相關研究。結果顯示，馬杜黴素誘導不同大小的phase-lucent細胞質空泡的大量積累。

結論

該研究採用RNA-Seq技術和基因表達譜分析顯示毒性劑量的馬杜黴素顯著改變原代雞心肌細胞的轉錄模式。共鑒定了1442個差異表達基因， 810個基因上調， 632個基因下調，通過GO和KEGG通路富集分析確定了馬杜黴素誘導的心臟毒性的關鍵路徑。它與細胞因子—細胞因子受體相互作用，細胞凋亡，鈣信號和細胞質空泡化相關。進一步通過實驗驗證了RNA-Seq結果並揭示了馬杜黴素的毒性機制。馬杜黴素處理后(0.05, 0.5 and 5 µg/mL)，炎症細胞因子TNF-α、IL-8、細胞凋亡率、caspase-3活性、細胞內鈣離子濃度、Ca 2+ -ATP酶活性均升高。這些結果表明，如果要減輕或治療馬杜黴素誘導的心肌損傷，應在治療過程中考慮炎症控制，細胞離子穩定，細胞凋亡減少以及細胞膜穩定。另外，通過形態學和透射電鏡觀察，在細胞質中發現大量的液泡形成。這是首次對馬杜黴素誘導原代雞心肌細胞轉錄組學研究，揭示了馬杜黴素通過多種分子機制在原代雞心肌細胞中表現出了毒性。對馬杜黴素誘導心臟中毒機制的的認識提供了更全面的理論依據。

參考文獻

Gao X G , Peng L , Ruan X C ,et al,(2017). Transcriptome profile analysis reveals cardiotoxicity of maduramicin in primary chicken myocardial cells. Archives of Toxicology :1-15. doi: 10.1007/s00204-017-2113-8.