久經臨床考驗下代測序平台，利用基因編輯和T細胞免疫防治腫瘤

作者丨張楠

這個故事可以從最近的一個重磅新聞說起。11月16日，美國FDA宣布全球著名的斯隆•凱特琳癌症研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，簡稱MSK）基於二代測序技術的癌症基因檢測分析平台MSK-IMPACT™獲得批准。這被視為2017年又一重大科學成果，影響深遠，將開闢癌症基因檢測的學術研究和商業化先河。

MSK-IMPACT™由MSK開發，是一個全面檢測癌症的平台，能一次性對病人腫瘤468個基因的基因突變及遺傳變異進行快速靈活的檢測。據了解，MSK-IMPACTTM檢測平台之所以能獲批，源於MSK近期完成的一個著名科學研究，結果發表已在2017年5月8日的《Nature Medicine》上。

《Nature Medicine》文章顯示，MSK研究者利用MSK-IMPACT™對超過1萬名晚期癌症患者進行了基因測序。這是迄今為止癌症患者中規模最大的腫瘤測序研究，也是具有里程碑意義的重要研究，為全球癌症診療開創了新模式。

（MSK發表的文章）

雖然MSK-IMPACT™技術歸MSK所有，但在實際研究中，尤其是涉及RNA檢測基因融合的部分，MSK卻採用了一種更先進的「AMP（Anchored multiplex PCR，錨定多重PCR）」專利技術，而不是MSK獨家研發的MSK-IMPACT™。

（MSK發表文章中關於運用AMP檢測技術部分）

該AMP技術是由恆特基因聯合創始人、首席科學顧問鄭宗立博士在哈佛醫學院工作期間發明，2014年成果發表在《Nature Medicine》上。當年該發明問世后，美國哈佛醫學院麻省總院的綜合診斷中心隨即採用，目前已作為主要檢測技術得到廣泛應用。

（鄭宗立博士2014年發表AMP文章）

替代金標準FISH的AMP技術實體腫瘤病理組織中攜帶突變的癌細胞占所有細胞比例可低至1~5%，而血液中遊離突變DNA的含量佔總遊離DNA可低至0.1%，或更低。所以，同時滿足多位點、高靈敏度檢測需求的新技術成為精準醫學檢測的關鍵所在。

目前，對指定基因位點進行富集再測序的技術可分為雜交捕獲和多重PCR兩大類。雜交捕獲技術作為傳統方法，不少生物公司在探索創新，試圖改進以往捕獲效率低，樣本使用量高，操作複雜等弊端；而多重PCR技術雖然操作簡便、靈敏度高，但由於反應體系中不同引物可能相互干擾，使得結果均一性較差，造成部分位點的漏檢，市場上很多公司難以克服上述瓶頸。鄭宗立博士攻克了多重PCR的設計難關，開發出獨特的多重PCR反應體系，採用全新的分子條碼設計，實現了多位點的均一覆蓋及超高靈敏度的液體活檢要求。

鄭宗立博士介紹，福爾馬林固定的石蠟組織樣本（FFPE）中，DNA和RNA常有斷裂、損壞等問題，是腫瘤分子診斷的難點。而AMP技術是一種為NGS生成富集目標序列文庫的快速、簡單、易擴展的方法，適用各種類型、質量參差不齊的臨床樣本，特別是微量DNA和RNA樣本，能在數小時內輕鬆建成測序文庫。

數據顯示，AMP技術於2013至2015年累計了一萬例以上的臨床應用驗證，結果證明擁有100%的臨床靈敏度和100%臨床特異性（實測986份樣本；檢測成功率97%，成果發表於2014年Nature Medicine）。正因其具有高效穩定、高靈敏度、高特異性等優勢，成為美國麻省總院主要的腫瘤分子病理檢測方法。作為比較，據文獻報道，Foundation Medicine的雜交捕獲方法的檢測成功率是85%（Nature Biotechnology，2013；註：還只是針對DNA檢測的成功率，而不包含更不穩定的RNA）。

（來源：美國麻省總院網站）

「也因為結果理想，我的導師John Iafrate（曾為FDA編寫FISH法檢測基因融合的標準實驗流程）在自己的實驗室已將金標準FISH法全替換成了AMP法了。」 鄭宗立博士曾在採訪中表示。

AMP最突出的優勢是能發現和檢測新的融合基因。麻省總院研究人員曾應用 AMP 技術，相繼發現ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK 3 等新的基因融合，ROS1 還被證實對克唑替尼敏感。這幫助醫生準確診斷ROS1病例（其他方法常常檢測為陰性），效果很顯著，該成果也發表於2014 年 11 月的《新英格蘭醫學雜誌》上。

實際上，除基因融合外，AMP也同時對其他變異類型進行檢測，包括點突變、插入和缺失、拷貝數、RNA表達等，幾乎覆蓋所有突變類型，可以使用 DNA 或 RNA 為模板，能對數個至數百個基因同時進行平行檢測。

促進基因編輯、細胞治療從研發邁向臨床在2017年11月23日中國精準醫療產業領袖峰會上，鄭宗立博士圍繞基因編輯和細胞治療等前沿科學技術做了主題報告。

他介紹，CRISPR可以對基因組內的任何基因進行修改，能高效地對任何生命體進行基因組「手術」。然而CRISPR基因編輯技術雖功能強大，但隱藏著巨大的安全隱患，因為切割不準確會造成脫靶。在應用上，我們在乎被編輯過的每一個細胞，因為哪怕僅有一個細胞因脫靶導致癌基因被激活或者抑癌基因被敲除，都會對患者的安全埋下隱患。

基於AMP技術平台的全基因組無偏尋找CRISPR脫靶技術（GUIDE-Seq）能全面、靈敏地找出CRISPR編輯脫靶位點。AMP技術平台是經過了臨床考驗的一個平台，並且獲得了全美審查最嚴格的紐約州的認證。因此，基於AMP技術平台而開發的CRISPR脫靶找尋方法可以為各種以CRISPR為基礎的細胞治療的安全把關，包括CAR-T或TCR-T等療法，將威脅因素找出來，推動CRISPR技術真正走向臨床。

一次性檢測所有突變、兩種核酸的測序技術繼AMP技術之後，鄭博士帶領恆特基因開發出新一代的PANO-Seq™全景測序技術。他創辦的恆特基因由此成為全球少數擁有自創反應體系的公司之一。PANO-Seq™首創單管集成 DNA + RNA 同時檢測，並在試劑和演算法上取得突破，以滿足液體活檢對靈敏度和特異性的更高要求，在一個反應管體系內一次完成所有變異類型及兩種核酸的「全景測序」目的。

據了解，PANO-Seq™技術的樣本來源更靈活，可選取實體腫瘤的手術切塊、穿刺樣本、石蠟切片或血液腫瘤的全血，或上述組織來源的DNA和RNA等；檢測涵蓋多個抑癌基因全編碼區及腫瘤驅動基因的突變多發區域。

貝殼社了解到，繼鄭宗立博士完成PANO-Seq™專利技術發明后，恆特基因正在進行全新產品的轉化升級和商業開發。

首先是針對臨床檢測基因融合困難這一痛點，以提高融合檢測質量為主，同時涵蓋其它突變類型。恆特基因CEO周鶴梅女士告訴貝殼社，基因融合現象在癌症檢測中非常重要，當前很多癌症檢測不出變異基因，有一大部分就是因為發生了基因融合。「目前國內很多腫瘤醫院專家在跟我們合作，因為很多樣本用不同技術、不同公司檢測結果都不穩定，所以想用恆特基因更全面的技術再檢測一次。」

2017年ASCO大會上，有報告指出只要檢測出NTRK基因融合，LOXO-101（TRK抑製劑）對不分組織來源的13種癌症都有療效，有望成為第一個上市的「廣譜靶向藥物」。周鶴梅女士認為，現階段已知的基因融合還是少數，但鄭博士發明的技術能發現新的融合類型，也為後續靶向藥物開發提供線索，所以融合基因檢測在未來必然會成為趨勢，今後人們會越發意識到其重要性。「所以我們的技術一直走在市場前面」，她說到。

今年3月，恆特基因還與中山市腫瘤研究所建立合作，前瞻性開展大型高危人群連續跟蹤樣本庫研究項目，為大規模隊列研究打下基礎。據悉，該項目就利用PANO-Seq™技術，對中山市腫瘤研究所收集的大量樣本進行腫瘤遊離核酸（ctDNA）全面檢測，為腫瘤早篩積累數據，提早布局。

恆特基因的另一個新方向是針對下一代腫瘤精準醫療測序，從T細胞而非傳統的腫瘤細胞視角為突破口進行測序，破解腫瘤難題。

針對腫瘤，鄭宗立博士更偏向觀察T細胞層面，因為T細胞能反映整個機體對腫瘤的免疫狀態。他解釋，傳統檢測方向是跟蹤腫瘤，需要檢測越來越多的基因，但可能抓住T細胞效果更好，是以不變應萬變的策略。「T細胞身上有識別腫瘤的鑰匙，是否可以藉助T細胞達到深入全面了解腫瘤的目的呢？這把鑰匙是真正的Holy Grail（聖杯），其應用可覆蓋精準免疫治療與精準預防，用於製備治療性疫苗的蛋白質工程和腫瘤早期發現」。恆特基因的PANO-Seq™全景測序將致力於實現該目標，開展對T細胞的深入研究。

總體而言，恆特基因利用PANO-Seq™全景測序技術向兩大方向持續發展，一個是腫瘤病理檢測，指導用藥檢測、伴隨診斷和腫瘤早篩檢測等應用；另一個方向是致力於提高基因治療、細胞療法的安全性，為臨床治療提供更安全的保障。

恆特基因CEO周鶴梅女士坦言，作為具有多年海外生命科學管理工作經驗的資深人士，她對恆特基因發展有非常清晰的認識。恆特基因今後將致力於為企業機構提供高質量產品和技術服務，眼光不局限國內，更放眼全球市場，參與國際競爭，力爭讓恆特基因成腫瘤防治，精準測序行業的領頭羊。