染色體外DNA（下篇）：腫瘤耐葯的秘密武器
文|吳思涵
前篇回顧
前面的兩篇有關ecDNA的文章，向大家介紹了攜帶著擴增原癌基因拷貝的染色體外DNA。這些小片段的ecDNA由於缺乏著絲粒，因此在細胞有絲分裂時，是隨機分配到兩個子代細胞中的。這樣的特性，使得部分腫瘤細胞可以迅速獲得大量原癌基因拷貝，並在腫瘤內部產生了高度異質性，從而驅動了腫瘤的演化與適應。這一篇文章主要向大家介紹，ecDNA會對腫瘤的治療帶來何種挑戰。
一、抗腫瘤藥物上調原癌ecDNA拷貝數的例子
提起腫瘤耐葯，排除葯代動力學的因素，最常見的機制便是腫瘤產生了新的突變，或激活了代償生存通路，使得腫瘤細胞可以在藥物的攻擊下存活。但讓人驚訝的是，腫瘤細胞竟然還可以通過改變基因拷貝數從而產生抗藥性。這裡先來為大家介紹一個經典的著名例子：化療葯甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）導致耐葯腫瘤細胞的二氫葉酸還原酶（Dihydrofolatereductase，DHFR）基因拷貝數升高。
MTX是一類抗腫瘤葉酸代謝葯，通過與DHFR酶的底物二氫葉酸（DHF）競爭性結合，阻斷了DNA的合成代謝，從而抑制腫瘤的生長。（如下圖所示）
早在上世紀四五十年代，MTX就已投入臨床使用。然而這個藥物卻不是萬能的，部分患者會在用藥一段時間后產生抗性。而由於MTX的毒性較強（葉酸代謝對正常細胞也很重要），因此不能輕易加高劑量。
MTX抗性機制有幾大類，一是藥物進入細胞的量變少了（藥物轉運蛋白表達量降低），二是藥物和DHFR的親和力降低（如DHFR基因產生突變），三是DHFR整體拷貝數增加了。這裡我們來談談第三個機制。
許多獨立研究表明，在MTX耐受的腫瘤樣本中，可以發現DHFR基因的拷貝數大量增加，甚至可高達幾十個拷貝。這些增加的拷貝數，不光可以出現在染色體上，還能以ecDNA的形式存在。如下圖的研究中，研究者發現，用MTX處理結腸癌細胞HT29，可以使其DHFR基因拷貝數增加。通過熒光原位雜交（FISH）實驗發現，這些擴增的DHFR位於ecDNA。而對照組並沒有發現這樣的現象。
同樣的現象，通過檢索文獻還能發現許多，這裡就不羅列了。而這樣的實驗結果證明，抗腫瘤葯可以上調原癌基因ecDNA的拷貝。本例中，大量表達的DHFR基因克服了MTX對葉酸代謝的抑制作用，維持DNA合成代謝活性，從而使腫瘤產生耐藥性。
二、抗腫瘤藥物下調原癌ecDNA數量的例子
前面的例子提到，腫瘤通過上調ecDNA數量而獲得藥物抗性，那有沒有可能通過下調的機制來獲得抗性呢？答案是有的。
2014年，我們實驗室在Science上發表了一篇文章，報道了靶向藥物厄洛替尼（Erlotinib，靶向EGFR蛋白激酶結構域）可以導致腫瘤細胞丟失藥物靶點EGFR的ecDNA，產生抗性，並在藥物撤除后重新出現EGFR的ecDNA。
首先，我們證明了腦膠質母細胞瘤（GBM）是一個異質的群體，同時含有高表達和低表達原癌基因突變體EGFRvIII的細胞。在EGFRvIIIhigh的細胞群體里，其PI3K/mTOR信號較強（上圖A），增殖快（B），具有較低的本底細胞死亡率（C），能攝取更多的葡萄糖（D和E）。而這群由EGFRvIII驅動的功能較為亢進的細胞群體，在面對靶向藥物Erlotinib的時候，也是死得最快的（F）。不過在用Erlotinib治療荷瘤鼠一段時間后，部分個體會出現藥物抗性（G）。通過進一步研究證明，無論是在有反應（Response）還是產生抗性（Resistant）的樣本，Erlotinib確實都抑制了EGFRvIIIhigh的細胞群體比例（上圖H）。那這個抗性是從何而來的呢？
我們把GBM注射到裸鼠皮下，讓它生長成一個攜帶EGFRvIIIhigh和low的腫瘤。隨後，將腫瘤解剖出來，通過流式分選的方法，將高、低表達的群體區分開來，再立刻分別重新注射到不同的裸鼠上。雖然前面的實驗結果表明，EGFRvIIIhigh的群體具有較亢進的惡性功能，但無論是low還是high的群體，在注射同樣細胞數量的情況下，都能讓裸鼠長出同等大小的腫瘤（上圖A）。而這些腫瘤裡面，又重新分化出具有high和low的異質群體（C）。同時令人驚訝的是，就算是一開始分離出high和low的群體，在體外培養一段時間后，high的平均表達量會逐漸降低，low的表達量會逐漸升高（B），最終這兩者又會變成同樣的混雜表達群體。這到底是基因表達強度的問題，還是有其他的原因？
通過進一步實驗，我們發現，原來是這些擴增的EGFRvIII位於ecDNA。通過有絲分裂時的隨機分配，EGFRvIII基因的拷貝數可實現動態調節。在普通狀態下，由於EGFRvIII高表達有利於腫瘤的生長，因此high的群體佔據了優勢。而在藥物Erlotinib的攻擊下，high的群體較為敏感，細胞死亡。然而在抗性群體中，絕大多數細胞都是低表達EGFRvIII的。通過FISH實驗和qPCR實驗（后一數據未在此展示）發現，這群Erlotinib抗性（ER）細胞，EGFRvIII基因的拷貝數特別低，並形成一種類似於均質染色區（HSR）的結構。而當藥物撤除之後，EGFRvIII的ecDNA又重新出現，並且high群體又重新佔據了主導。
這種動態調節ecDNA拷貝數，形成了一種類似「躲貓貓」的機制，讓腫瘤逃避了藥物的攻擊，並在藥物撤除后捲土重來。
三、尚待解決的問題：ecDNA數量動態調控的機制
那麼現在問題來了，腫瘤細胞到底是通過什麼方法來實現這種ecDNA數量的動態調控呢？遺憾的是，迄今為止，尚未有任何研究針對這個問題提供了明確的答案。
但這並不妨礙我們在此提出兩種假說：1、被動選擇機制；2、主動調節機制。
假如將每個腫瘤細胞視為獨立的個體，而這些基因表達量不同的個體組成了一個異質的群體。接著，我們將藥物處理視為一種環境選擇壓力。在第一例中，高表達DHFR基因的群體在藥物MTX的壓力下，具有更強的存活能力，因此得以保留與遺傳（即產生子代細胞），而低表達的則被淘汰掉（死亡）。在例二中，低表達EGFRvIII的細胞則在藥物Erlotinib的壓力下更有存活優勢。經過長期的藥物選擇，劣勢群體逐漸消失，而優勢群體被富集起來。因此最後我們能發現，腫瘤整體的DNA拷貝數發生了變化，產生了耐藥性。此為被動選擇機制。
而主動調節機制則是，腫瘤細胞通過某種未知的途徑，「感應」環境的壓力，繼而產生更多或者減少攜帶原癌基因ecDNA的數量，從而產生抗性。
然而無論是哪一種機制，也僅有ecDNA的存在，才能讓腫瘤快速改變基因拷貝數，從而獲得強大的適應性。回顧《中篇》的內容，我們不難理解，假設擴增的原癌基因全部位於染色體上，要實現拷貝數的快速變化，實在太難了。
最後，本司機要聲明的是：1、以上兩個機制僅是假說，尚未有發表的實驗數據的支持，所以不要太當真。2、這兩個假說機制可以只存在一種，也可能同時存在。3、我們實驗室正在進行相關研究，但在文章正式發表之前需要保密，因此具體細節無可奉告。
文 | 吳思涵
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