引物合成純化 淺談問答
引物純化方式有哪些？
引物常用的純化方式C18脫鹽、RPC純化、PAGE純化、HPLC純化。
純化方式
詳細說明
C18柱脫鹽
又稱為簡易反相柱，對DNA有特異性吸附，可被有機溶液洗脫，但不會被水洗脫，因此能有效地去除鹽分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。該方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對於需要用於測序、克隆的引物不能使用這個級別。
RPC純化
RPC純化是通過反相凈化濾芯 (Reverse Phase Cartridge) 對引物進行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較，RPC是一種有效並且更加經濟的純化方式。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質如 C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA，並且可以用水輕鬆地將切割下來的保護基團和短的引物片段從反相柱上洗掉。RPC純化的引物可以應用於DNA測序、PCR及基因合成等。
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PAGE純化
PAGE純化法是使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，對引物DNA進行分離，然後從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大於90%，對長鏈Oligo DNA (大於50 mer)的純化特別有效。
HPLC純化
HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對引物DNA進行純化。該方法用於分離純化或分析時能達到很高的純度和靈敏度。在引物DNA的分析和純化中，常用的有離子交換（ion-exchange）HPLC和反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：純度大於90%；ion exchange HPLC：純度大於95%，可以有效的去除N-1短片段。HPLC純化主要用於短鏈和修飾引物的純化。該法的缺點是成本較高，批量生產效率不高。
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5. 合成的引物5』端是否有磷酸化？
合成的引物5』端為羥基，沒有磷酸基團。如果需要，您可以用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。
6. 最長可以合成多長的引物？
引物越長，出現問題的概率就越大。除非有特殊需要，我們建議合成片段長度不要超過80 mer,按照目前的引物合成效率，80 mer的粗產品，全長引物的百分比不會超過40%，後續處理還會丟失很多，因此最後的產量很低。金斯瑞最長可合成110 base的引物。
7. 為何長鏈引物的收費要比短鏈引物要高？
在合成長鏈引物時，所需要的試劑比短鏈引物要多，尤其是長度大於90 base的引物。由於成本的增加，從而導致價格較高。
8. 交付引物質量好壞的判斷標準是什麼？
合成的引物和您的定單序列一致，而不是能否擴增出您所需要的產物。
9. PCR產物經過克隆以後測序發現引物區與合成序列不相符合，怎麼辦？
多數情況是PCR過程和克隆過程中引入的錯誤。遇到這種情況，請您
1) 重新挑取克隆測序，會有找到正確克隆的可能
2) 可以要求我們重新免費合成引物。
10. 測序發現引物有突變是怎麼回事？
引物合成是一種多步驟的化學反應，每一步的合成效率最高也就是99%，副產品不可以避免。鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。在您PCR擴增后克隆測序的時候，為了節約時間和提高成功率，我們有如下建議：
1)請您在檢測到陽性克隆后準備2~3個陽性克隆子的菌液，盡量送測2個或以上克隆，這樣成功率將大大提高，也節約很多時間；
2)也可以先送測1個克隆，其餘兩個克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出現個別點突變或缺失，立即將餘下的兩個克隆送測；
3）這樣得到正確的序列可能性將非常高，並且可以免去重新PCR、連接、克隆以及篩選的一系列實驗操作，更省去了很多時間；