《自然》最新研究：let-7家族與神經母細胞瘤
《自然》最新研究：let-7家族與神經母細胞瘤
導語
來自波士頓兒童醫院、德國科隆大學醫院等機構的研究人員證實，在神經母細胞瘤中多種機制破壞了let-7microRNA家族。這一重要的研究發現發布在7月6日的《自然》（Nature）雜誌上。
《自然》報道摘要
《Multiple mechanisms disrupt the let-7 microRNA familyin neuroblastoma》.Nature. 2016 Jul 6. doi:10.1038/nature18632.
神經母細胞瘤的預后與MYCN基因擴增相關。MYCN基因本身是let-7的一個靶標，let-7作為miRNA的抑癌基因家族在許多癌症中發揮作用。LIN28B是let-7的生物合成抑製劑，它在神經母細胞瘤中過表達並調控MYCN基因。MYCN擴增的疾病中，MYCN信使RNA的水平是非常高的，足以充當let-7miRNA海綿（miRNAsponge）。然而，MYCN的競爭性內源RNA(ceRNA)功能也導致了LIN28B在MYCN擴增細胞系中可有可無，表明LIN28B有可能發揮了冗餘的let-7抑制功能。此外，還發現在神經母細胞瘤中let-7遺傳丟失非常常見，這與MYCN擴增呈負相關，與不良結局獨立相關，為神經母細胞瘤中的染色體喪失模式提供了一個理由。由此，研究人員提出在神經母細胞瘤中通過LIN28B活性、MYCN海綿般吸收或遺傳丟失幾種不同的機制破壞了let-7。這一模型對於認識神經膠質母細胞瘤的發病機制、疾病建模及合理地設計治療策略具有重要的意義，有可能代表了人類癌症一種更普遍的特徵。
let-7簡介
Büssing I, Slack F J, Großhans H. let-7 microRNAs indevelopment, stem cells and cancer[J]. Trends in molecularmedicine, 2008, 14(9): 400-409.
let-7最早在秀麗隱桿線蟲中發現，它是線蟲時序性發育的關鍵性調控因子，通過沉默維持幹細胞樣特徵的相關基因而誘導細胞分化，促進線蟲從幼蟲到成蟲的轉變。
Roush S, Slack F J. 《The let-7 family of microRNAs》.Trends in cell biology, 2008, 18(10): 505-516.
let-7是miRNAs中最豐富一類。人lec-7miRNA家族共有13位成員，分別為let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7e、let-7d、1et-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-202和miR-98，該家族所有成員的5』端具有高度保守的核苷酸序列，即「TGAGGTA」，稱為「種子序列」，這些成員分別位於9個不同的染色體上。
癌症發生、進展和侵入是與癌症幹細胞啟動有關。癌症幹細胞的啟動與上皮細胞向間充質的轉化(EMT)、炎性微環境及細胞周期調控紊亂等緊密相關，它們在癌症的發生中起到了重要的作用，而這些因素與let-7家族異常表達有關。let-7有許多靶基因包括RAS、MYC、HMGA2、CyclinD、DICER和CDC25等等，它們與1et-7相互作用參與細胞的生命過程，還有腫瘤的發生和發展。
LIN28的基本結構和功能
Thornton J E, Gregory R I. 《How does Lin28 let-7 controldevelopment and disease?》. Trends in cell biology, 2012, 22(9):474-482.
LIN28家族包含兩個成員, 即LIN28A和LIN28B,是一類小於30kDa的蛋白。LIN28蛋白結構中包含一個冷休克結構域和一對CCHC鋅指模體, 在RNA結合過程中發揮功能,其中LIN28B結構域中還包含核定位信號和核仁定位信號,提示LIN28B定位在核內。LIN28主要通過對靶miRNAs的表達抑制而發揮重要功能。研究發現,LIN28蛋白主要在胞漿中誘導let-7前體(pre-let-7) 3′端的尿苷化,而尿苷化的let-7前體(up-let-7)不能被Dicer酶加工, 因而阻遏let-7的成熟。
Viswanathan S R, Powers J T, Einhorn W, et al. 《Lin28 promotestransformation and is associated with advanced human malignancies》.Nature genetics, 2009, 41(7): 843-848.
LIN28參與腫瘤的形成過程, Viswanathan等指出, 在約15%的惡性腫瘤中存在著LIN28的激活。研究表明,LIN28的高表達與腫瘤的惡性程度和病人的不良預后密切相關。
LIN28/let-7通路在相關惡性腫瘤中的作用
Ji J, Wang X W. 《A Yin-Yang balancing act of thelin28/let-7 link in tumorigenesis》. Journal of hepatology, 2010,53(5): 974-975.
作用LIN28與let-7之間是一種負反饋調節機制,LIN28抑制let-7的成熟過程,而LIN28也是let-7的下游靶基因, let-7通過與LIN28mRNA的3′-非編碼端(3′-UTR)結合而阻遏其翻譯。與LIN28/let-7信號通路相關的影響因子包括原癌基因(C-myc)、癌基因(ras)、高遷移率族蛋白(HMGA2)、RE1沉默轉錄因子(REST)和細胞核因子kb蛋白(NF-κB)等。有學者指出,LIN28/let-7通路在腫瘤形成過程中保持著一種陰陽平衡的狀態。
LIN28/let-7/MYCN軸在神經母細胞瘤中的作用
Molenaar J J, Domingo-Fernández R, Ebus M E, et al.LIN28B induces neuroblastoma and enhances MYCN levels via let-7suppression[J]. Nature genetics, 2012, 44(11):1199-1206.
2012年《NatureGenetics》報道，LIN28B通過調控let-7家族調控發育進展。他們在動物水平驗證了LIN2B的作用，發現LIN2B基因組異常在高危神經母細胞瘤中廣泛高表達，Lin28B的高表達與神經母細胞瘤的惡性程度及預后相關。LIN28B通過抑制let-7引起了MYCN蛋白的上調。LIN28B–let-7–MYCN信號通路阻斷了正常神經母細胞和神經母細胞瘤的分化。對於該信號通路的干預具有很好治療前景。
在神經母細胞瘤中多種機制破壞了let-7 microRNA家族
在神經母細胞瘤中具有十分完整LIN28B/let-7/MYCN軸（axis）。let-7通過調控MYCN3'UTR來調控MYCN表達；突變MYCN中let-7a結合位點明顯增強了MYCN表達。LIN28B作為let-7抑製劑，當LIN28B高表達時候明顯增強MYCN的表達。let-7a與MYCN在蛋白水平負相關十分明顯。
在MYCN擴增細胞中LIN28B是可有可無的。以前有報道LIN28B/let-7/MYCN調控環路發現用慢病毒shRNA干擾LIN28B時候可以明顯抑制MYCN蛋白表達以及細胞的生長，本文作者重複了前人的實驗，在LINN28BshRNAg干擾后並沒沒有發現let-7水平的去抑制，而且通過過表達shRNA抗性LIN2B的回復實驗並沒有能夠營救表型。由此作者認為以前報道的shRNA干擾效應是由於髮夾毒性效應造成的。（前人的實驗要想推翻，要用實驗驗證和推理來證實）。得到了這個推論后，作者用更為縝密的實驗驗證作者觀點。首先，用siRNA來干擾LIN28B而不是髮夾結構的shRNA，選用了5個靶點，4個靶點能夠抑制LIN2B同時可能去抑制let-7比表達水平，但是MYCN表達水平卻並沒有受到影響。然後，由於siRNA效果只能部分抑制LIN28效果，為了更為夯實的證據，可以用CRISPR/cas9技術用4個gRNA來干擾LIN28B，發現LIN28B明顯降低，但是MYCN蛋白表達沒有變化，並且並沒有影響細胞增長，與siRNA效果一致。由此看來，let-7家族能夠被活躍的去抑制的結果與前人報道相符以外，LIN28B的降低或者缺失對於MYCN擴增的神經母細胞瘤來說是沒有明顯影響。
擴增的MYCNmRNA是let-7的「miRNA海綿」。從目前MYCN和let-7表達關係來看，作者推理滿足ceRNA模型。利用MYCN擴增細胞系(BE(2)C and Kelly)和MYCN非擴增細胞系(SH-SY5Y)進行RNA-seq。發現let-7靶標池中中MYCN，HMGA2,CCND1等基因滿足ceRNA模型規律。並且用熒光素酶實驗做了再次驗證。而且作者不但外源性進行驗證，還對內源性的let-7靶標進行驗證，都符合ceRNA模型規律。
在神經母細胞瘤中let-7頻繁染色體缺失。作者採用比較基因組雜交（aCGH：array-based Comparative GenomicHybridization）是通過在一張晶元上用標記不同熒光素的樣品（病例樣品和對照樣品）進行共雜交可檢測樣本基因組相對於對照基因組的DNA拷貝數變化（CNV），常用於腫瘤或遺傳性疾病全基因組CNV檢測，直觀地表現出腫瘤及遺傳性疾病基因組DNA在整個染色體組的缺失或擴增。對腫瘤而言缺失片段可能包含抑癌基因，而擴增片段則可能存在致癌基因。運用aCGH發現let-7a2和let-7g缺失。
假定模型：擴增MYCN會扣留成熟的let-7分子，在MYCN擴增疾病中預計選擇性壓力引起let-7丟失會被減輕。在非MYCN擴增的神經母細胞瘤中，let-7的丟失、LIN28B以及let-7和MYCN負相關性在神經母細胞瘤的發病以及預后等起著關鍵性作用；然而在MYCN擴增性的神經母細胞瘤中，MYCN作為let-7的miRNA海綿抑制let-7在疾病中的機制顯得更為重要，並且MYCN的擴增與let-7丟失在疾病作用有協同疊加效應。
let-7家族與神經母細胞瘤模型不斷演化與成熟
在神經母細胞瘤中多種機制破壞了let-7 microRNA家族。
a）染色體中let-7的丟失，抑制了pri-let-7轉錄和表達；
b）LIN28B抑製劑Drosha，抑制了pri-let-7進一步Drosha剪切成pre-let-7；
c）LIN2B抑制DICER，從而抑制pre-let-7進一步DICER剪切成mature let-7;
d）擴增的MYC mRNA作為ceRNA抑製成熟let-7
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