作者：朱麗珍，房雪峰，袁瑛

單位：浙江大學醫學院附屬第二醫院

袁瑛教授，浙江大學醫學院附屬第二醫院腫瘤內科副主任，主任醫師、博士生導師。中國抗癌協會大腸癌專業委員會 委員、遺傳性大腸癌學組組長，中國抗癌協會轉移專業委員會委員，中國抗癌協會腫瘤藥物臨床研究專業委員會委員，中國抗癌協會腫瘤靶向治療專業委員會委員，中國抗癌協會胰腺癌專業委員會多學科臨床協作學組委員， 中國醫師協會外科醫師分會MDT專委會常務委員， 中國女醫師協會臨床腫瘤專業委員會常務委員， 中國臨床腫瘤協會（CSCO） 理事、青年委員， 衛計委消化道腫瘤合理用藥專家委員會核心專家

近年來，腫瘤免疫治療特別是免疫靶向藥物在惡性腫瘤治療方面顯示出振奮人心的效果及巨大的潛能。轉移性結直腸癌(mCRC)患者也從免疫治療中看到新希望，尤其是在有錯配修復功能缺陷(dMMR)的mCRC患者中，免疫檢查點阻滯(CPI)治療(抗PD-1藥物單葯治療)可以獲得40%的客觀反應率(ORR)，臨床獲益率高達78%。並且，免疫治療間聯合或與傳統放化療等聯合對mCRC也顯示出較好的療效。雖然免疫治療前景樂觀，但是仍然面臨諸多問題，如很多動物實驗中證實有效的方法在臨床試驗中卻無效；僅有部分腫瘤患者對免疫治療有反應，例如無錯配修復功能缺陷(pMMR)mCRC患者對抗PD-1的治療反應不佳；此外，免疫治療療效預測及評估標準仍有待研究等。本文主要就mCRC免疫治療進展、療效評估及療效預測幾方面進行論述。

mCRC免疫治療進展

1.1 疫苗治療

腫瘤疫苗治療原理是含腫瘤抗原基因或腫瘤抗原肽的疫苗，通過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應，增強機體的抗癌能力。轉移性結直腸癌的研究中主要有肽疫苗、腫瘤細胞疫苗和樹突狀細胞疫苗等。作為mCRC肽疫苗的靶向腫瘤抗原包括癌胚抗原、p53蛋白、癌-睾丸抗原等。目前，腫瘤疫苗治療仍處於動物研究及臨床試驗階段，有效的疫苗治療方法仍有待進一步研發和驗證，隨著新的疫苗製備技術和對腫瘤免疫的不斷探索，腫瘤疫苗治療可能會為mCRC患者帶來更多臨床獲益。

1.2免疫細胞治療

免疫細胞治療需先從患者腫瘤組織或血液中分離出相關的淋巴細胞，經體外改造、細胞因子激活和擴增並回輸，達到殺傷腫瘤細胞的目的。主要包括腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)治療、細胞毒性T細胞(CTL)治療、經基因修飾的T細胞受體治療(TCR-T)、嵌合抗原受體治療(CAR-T)、淋巴因子活化殺傷細胞(LAK)治療、細胞因子介導的殺傷細胞(CIK)治療和樹突狀細胞誘導的殺傷細胞(DC-CIK)治療等。

最近備受爭議的CIK和DC-CIK等免疫細胞治療雖然不能特異性識別腫瘤細胞相關抗原以特異性殺傷腫瘤細胞，然而Zhao等進行的Ⅱ期臨床研究發現，一線行CIK聯合FOLFOX4(奧沙利鉑+氟尿嘧啶+葉酸)化療的61例mCRC患者中位OS達36個月，中位無進展生存期(PFS)達16個月；對比單純化療的61例mCRC患者16個月的OS和10個月的PFS仍看到些許臨床獲益。說明CIK和DC-CIK在腫瘤治療中可能有較好療效，但這需要更多臨床試驗驗證。但是，相關研究較為零散，病例數有限，往往難以做到嚴格的前瞻性、雙盲和隨機，其臨床價值仍需要更多的臨床試驗來驗證。此外，我國在曹雪濤教授牽頭下對既往的DC-CIK治療進行改進，將患者自身腫瘤抗原負載DC細胞，進而能更有效地誘導機體特異性免疫應答，並聯合mFOLFOX化療方案(奧沙利鉑+氟尿嘧啶+葉酸)治療晚期結直腸癌的Ⅱ期隨機對照臨床研究，主要終點客觀緩解率也獲得陽性結果，初步數據顯示，DC+CIK聯合化療組疾病緩解率達45.1%(32/71)，而單純化療組為25.4%(18/71)。

TCR-T是將針對腫瘤特異性抗原的受體導入T細胞中，再將這些經過基因修飾的T細胞回輸給患者來治療腫瘤。理想的靶抗原是選擇性高表達於腫瘤組織而不表達於正常組織的腫瘤特異性抗原，但是此類抗原目前很難找到，故用腫瘤相關抗原替代。TCR-T相關的腫瘤相關抗原包括分化抗原(如CEA)、過表達抗原、癌-睾丸抗原和腫瘤突變產生的新抗原等。值得注意的是，癌-睾丸抗原是腫瘤相關抗原中較為特殊的一類，可在多種來源的腫瘤細胞表面表達，但在正常組織中僅限於睾丸和胚胎組織。同時，生殖細胞不表達HLA分子，並且血睾屏障的存在保護睾丸免受攻擊，所以針對癌-睾丸抗原的細胞治療一般不會對正常組織細胞產生免疫毒性。New York esophageal squamous cell carcinoma 1(NY-ESO-1)是這類抗原研究的熱點。其在惡性黑素瘤、滑膜肉瘤和食管癌等多種腫瘤中過表達，多項研究發現，其對腫瘤篩查、評估預后和治療方面均表現出較大潛力。

但是，TCR-T具有一定的局限性:如其療效決定於TCR和抗原的親和力，若TCR低親和力、腫瘤下調主要組織相容性複合體(MHC)表達將降低其療效；人類白細胞抗原(HLA)等位基因的排列組合具有多樣性，TCR-T要求針對每例患者改造T細胞，這將增加這項技術的推廣難度；轉染后T細胞的α和β亞基會錯誤地和自身TCR配對，不能識別抗原或錯誤識別。

嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是指將能夠識別腫瘤相關抗原的單鏈抗體和T細胞內活化基序藉助鉸鏈結構連接為一體，轉染T淋巴細胞，賦予T淋巴細胞對腫瘤抗原的高親和性和對腫瘤細胞特異性殺傷能力，被轉染的T細胞在體外擴增后回輸患者體內，T淋巴細胞發揮其特異性識別腫瘤並且殺傷腫瘤細胞。經肝動脈注射靶向CEA的CAR-T的Ⅰ期臨床試驗結果顯示，CEA+的多發性肝轉移的mCRC患者獲得較好的臨床效果。

總體來說，TCR-T和CAR-T治療血液疾病表現出令人驚喜的療效，但在實體瘤中療效不盡如人意，除與其脫靶效應和細胞因子風暴等不良反應相關外，還可能與下列因素相關:(1)TCR-T和CAR-T細胞在實體瘤內存活時間有限；(2)靶抗原特異性欠佳，T細胞不能做到精確特異性殺傷腫瘤細胞；(3)TCR-T和CAR-T細胞難以精準到達腫瘤所在位置；(4)實體瘤微環境內存在抑制性免疫細胞及介質等。針對以上問題，目前已有多種解決方法，因此TCR-T和CAR-T在實體瘤中的應用值得期待，如設計針對雙靶抗原的TCR-T或CAR-T、使T細胞表達促存活基因以及聯用anti PD-1等。

1.3免疫檢查點阻滯

T細胞表面有激活T細胞的受體，如cluster of differentiation 28(CD28)、OX40、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)和CD27等，與抗原呈遞細胞上相應配體結合后可以促進T細胞活化發揮抗腫瘤效應；T細胞表面同時還有抑制T細胞活化的受體，如細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡受體1(PD-1)，稱為免疫檢查點，當其和抗原呈遞細胞上相應的配體結合后，傳遞的信號能夠抑制T細胞活化，導致T細胞增殖、分泌細胞因子以及殺傷腫瘤細胞的功能下調，以維持免疫的穩態。腫瘤細胞表面常可高表達抑制T細胞活化的配體以削弱T細胞對其殺傷清除能力，因此通過藥物靶向結合腫瘤細胞上的這些配體或T細胞上的受體，T細胞活化抑制現象得以改善，使T細胞儘可能地發揮其抗腫瘤效應。

近年來，抗免疫檢查點受體如CTLA-4和PD-1的治療展示出較好的臨床治療效果。PD1有PD-L1和PD-L2這2種配體，阻斷PD-1和PD-L1之間的相互作用可增強T細胞應答反應並增強其抗腫瘤活性。有研究報道，mCRC患者對抗PD-1和抗PD-L1治療並沒有很好的反應。也有研究報道，PD-L1表達與CRC有較好的預后相關，PD-L1表達與腫瘤浸潤的PD-1 CD8+T細胞數量正相關，且此種關聯只出現在pMMRCRC患者中。

抗CTLA-4藥物ipilimumab對黑色素瘤顯示出較好療效，但單葯對mCRC無效；抗CTLA-4藥物tremelimumab在mCRC上療效類似。研究顯示，ipilimumab與抗PD-1單抗nivolumab聯用與nivolum-ab單葯治療mCRC比較，在MSI-H晚期CRC患者中，nivolumab 3mg/kg單葯組ORR為25.5%(12/47)，而nivolumab 3mg/kg+ipilimumab 1mg/kg聯用組ORR為33.3%(9/27)；而在微衛星穩定的晚期CRC中，nivolumab 3mg/kg+ipilimumab 1mg/kg治療組ORR為0.0%，nivolumab 3mg/kg+ipilimumab 3mg/kg組ORR為10.0%(1/10)。與抗CTLA-4藥物ipilimumab比較，靶向PD-1/PD-L1軸的藥物最明顯的區別是抗PD-1/PD-L1的阻斷劑毒性更小。多數毒性可以通過支持治療或類固醇類激素得到改善。但抗PD-1/PD-L1軸治療仍存在其他問題，如僅有部分患者對其敏感。

除nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、ipilimumab和tremelimuma外，其餘還有多種抗PD-1/PD-L1軸和抗CTLA-4葯正在mCRC患者上進行臨床試驗。此外，其餘多種靶向免疫調節受體的藥物在mCRC中的應用也處於臨床試驗階段，如抗淋巴細胞活化基因3(LAG3)蛋白。

1.4其他免疫治療

1.4.1免疫激動型抗體

T細胞表面有激活T細胞的受體，如CD28、OX40、GITR、4-1BB及CD27等，與抗原呈遞細胞上相應配體結合后促T細胞活化發揮免疫效應。免疫激動型抗體多數是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族。目前mCRC治療正處於臨床試驗階段的包括靶向CD27、OX40、GITR、4-1BB及CD40的激動型抗體。

1.4.2免疫系統調節治療

某些物質(包括細胞因子和某些生長因子)有助於調節免疫系統的活性，激活淋巴細胞，增強抗腫瘤免疫應答。目前白細胞介素和干擾素2種細胞因子已用於惡性腫瘤的治療。將此類藥物與其他免疫治療方法聯合可能產生更優的治療效果。

1.4.3溶瘤病毒

溶瘤病毒是能特異性感染和裂解腫瘤細胞、並引起腫瘤部位免疫反應但不損傷正常細胞的特殊病毒。在一項Ⅰ期臨床試驗中，一線治療失敗的12例mCRC患者在化療前經肝動脈給予溶瘤病毒NV1020治療4周，所有患者均出現CEA水平下降，中位生存期為25個月，其中1例腫瘤體積縮小75%。另外，一項Ⅱ期臨床試驗表明，NEO-102(嵌合單克隆IgG1抗體)單葯可改善mCRC的OS，且耐受良好，提示嵌合單克隆抗體可能有較好的抗腫瘤效果。

免疫治療療效評估標準(irRC)

因為腫瘤免疫治療獨特的抗腫瘤機制，在臨床上套用評價細胞毒藥物療效評價標準(如RECIST標準和WHO標準)可能會產生一些錯誤的判斷。例如一些患者經免疫治療后在臨床上出現腫瘤增大或出現新病灶，按照RECIST標準或WHO標準會判斷為腫瘤進展，但是病理檢查后發現增大的病灶並不是腫瘤增殖所致，而是因為T細胞浸潤引起的炎性反應，這些患者如果繼續給予免疫治療會使得腫瘤縮小。此外，免疫治療不像化療一樣可以快速、顯著地使腫瘤退縮，而是需要一定的時間起效，其療效也未必能反映在腫瘤大小上，因此傳統的RECIST標準和WHO標準不能精準、客觀地反映其療效。

2013年專家在RECIST標準的基礎上提出irRC標準用於腫瘤免疫治療的反應評估。irRC標準將可測量的新發病灶計入總腫瘤負荷，再對比每次總腫瘤負荷進行療效評估，而傳統RECIST或WHO標準則將新發病灶算為疾病進展。由於免疫治療中出現新病灶很有可能是T細胞浸潤腫瘤微環境引起的免疫反應，因此irRC更強調的是腫瘤總負荷情況而非新病灶。在免疫治療期間發現疑似新病灶或腫瘤增大時，irRC要求臨床醫師評估間隔時間≥4周，但是既往研究發現，原先疑似進展的腫瘤3個月左右才在影像上出現穩定或改善並最終臨床獲益，因此4周時間可能太短，臨床醫師需要結合患者是否在治療期間出現癥狀改善和體力狀態改善等徵象綜合分析來判斷免疫治療是否對患者有益，從而決定是否繼續免疫治療。有研究者認為，對於疑似新病灶或腫瘤增大不能確定的病例，結合病理活檢或許是個可行的辦法。

此外，irRC聯合其他量化指標也許能更好地幫助評估免疫治療反應，如通過Hounsfield Unit檢測CT上腫瘤密度減低程度。在一項用ipilimumab聯合貝伐珠單抗治療進展期黑色素瘤的研究中，經治療1/3的患者CT檢查顯示，腫瘤密度減低≥15%，但是尚未能明確其與治療反應的具體關係。同時，用影像學方法評估免疫治療不良事件有待進一步研究。

已有學者研究分子影像技術在腫瘤免疫治療中療效評估的應用。腫瘤浸潤淋巴細胞可能是預測免疫治療反應的一個標誌物，但是一般需要通過有創活檢去檢測，並且活檢取材部位等可能影響腫瘤浸潤淋巴細胞的檢測結果。如果能通過分子影像方法去檢測腫瘤浸潤淋巴細胞，可獲得全面的、無創的免疫反應評估，從而預測療效。目前已有相應探針用於此種分子影像檢查，如識別活化T細胞的探針、識別活化T細胞表面IL-2受體的探針等，還有靶向PD-L1、TGF-β和巨噬細胞的探針。

預測CPI療效的標誌物

儘管免疫治療展示出振奮人心的抗腫瘤效果，但是每種免疫治療方法僅有部分患者有效，因此急需找到能夠預測療效的標誌物。

3.1腫瘤微環境內淋巴浸潤

早期研究表明，腫瘤微環境內高密度的CD3+CD8+CD45RO+顆粒酶+T細胞(即有抗原經驗的溶細胞效應T細胞)與結直腸癌低複發風險和較長的OS相關；腫瘤微環境內免疫細胞密度的評估預後效能優於傳統TNM分期。Kirilovsky等提出一個免疫評分:分別對腫瘤內部和侵犯邊緣這2個區域的CD3+T細胞和CD8+T細胞進行計數，再根據計數計算出2種細胞在各區域的免疫密度，分為高密度和低密度；2個區域和2種密度組合形成I0～I4這4類分數。研究報道，用此免疫評分評估經中位5.9年隨訪的Ⅱ/Ⅲ期根治術后的結腸癌患者顯示，評分低的患者腫瘤複發時間(TTR)短於評分高的患者。此外，Tumeh等發現，治療前黑色素瘤腫瘤邊緣CD8+T細胞密度與抗PD-1療效相關。此評分系統或許可以用於預測免疫治療療效。

3.2微衛星不穩定(MSI)

人體內存在一套修復DNA鹼基錯配的系統，稱之為DNA錯配修復(MMR)系統。其對保持遺傳物質的完整性、穩定性及避免遺傳突變的產生具有重要作用。MSI是MMR缺失的結果，由於DNA重複單元的插入或缺失而導致的。MMR胚系突變最早是在Lynch綜合征中發現，接著在散發性腫瘤包括結直腸癌、胃癌、子宮內膜癌、十二指腸癌及前列腺癌中發現MMR基因體細胞突變。

雖然整體CRC患者對抗PD-1治療不敏感，但標準治療失敗的mCRC患者，如為dMMR患者，單葯pembrolizumab治療可以產生40.0%(4/10)的客觀反應率和77.8%(7/9)的疾病緩解率；而pMMR患者0例獲得CR或者PR的療效。在同一研究中單葯pembrolizumab治療給dMMR非CRC患者帶來71.4%(5/7)的ORR和66.7%(4/6)的臨床獲益率，說明pembrolizumab治療的療效與腫瘤類型關係不大，而主要與腫瘤的MSI狀態有關。與mic-rosatellite instability low(MSI-L)結直腸癌比較，MSI-H結直腸癌的腫瘤微環境內有大量T細胞(尤其是CD8+T細胞)浸潤，浸潤性CD4+T細胞向T輔助細胞表型傾斜，而CD8+T細胞是發揮細胞毒性的主要細胞，攻擊腫瘤細胞。並且，MSI-H腫瘤高水平表達大量免疫檢查點分子，包括PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG3；也高表達IDO1，而PD-L1高表達提示對免疫檢查點阻滯劑(CPI)治療敏感。此外，MMR功能的缺失可引起大量基因突變，全基因組測序發現，每個dMMR腫瘤細胞平均有1 782個突變，而pMMR腫瘤細胞只有73個突變，突變產生新抗原，引發大量T細胞反應，而抗PD-1治療可促進T細胞殺傷腫瘤細胞。以上3點可能是MSI CRC對抗PD-1治療敏感的原因。

3.3基因突變總負荷

基因突變、重排、插入及缺失均可編碼產生腫瘤特異性新抗原，並且只需單個DNA改變就能產生多種可能被T細胞識別的表位。突變總負荷越大的腫瘤可能產生越多新抗原，因此腫瘤會被大量的腫瘤特異性T細胞攻擊。抗PD-1治療可以使抗腫瘤T細胞反應得以更充分的發揮，因此有更高突變負荷的腫瘤(與是否為致癌突變無關)對抗PD-1可能更敏感。

有限的研究已經顯示，突變總負荷越大的腫瘤對CPI越敏感。黑色素瘤、NSCLC、Lynch綜合征、膀胱癌和胃癌等有很高突變負荷的腫瘤對抗PD-1或抗PD-L1反應更佳。吸煙相關肺癌的突變負荷較非吸煙相關肺癌明顯增高，因此吸煙NSCLC患者對抗PD-1有更好的反應。而像胰腺癌、前列腺癌和非MSI-H的CRC，這些突變負荷較低的腫瘤對抗PD-1/PD-L1途徑的治療反應較差。目前沒有明確的截斷值來劃分高突變負荷和低突變負荷腫瘤。臨床上也有總突變負荷很高的患者對抗PD-1不敏感，而低突變負荷患者對抗PD-1敏感，因此目前尚不能將此作為排除患者接受CPI治療的標誌物。

3.4腫瘤微環境內PD-L1的表達水平

在一些腫瘤中，PD-L1表達繼發於信號通路突變或染色體變化，其中基因突變總負荷比單個致癌驅動基因突變有更大的作用，在如黑色素瘤和吸煙相關肺癌這些癌基因驅動型腫瘤以及DNA損傷修復功能缺失的腫瘤中這一現象更為明顯。而在非Lynch綜合征的結直腸癌和胃癌等腫瘤中，腫瘤浸潤性免疫細胞中幾乎沒有PD-L1的表達，腫瘤細胞也很少表達PD-L1。此外，多種細胞如腫瘤細胞、活化的淋巴細胞和腫瘤相關巨噬細胞等都可在細胞質或細胞表面表達PD-L1，這對免疫抑制的作用尚不明。還需注意的是，很多參與抗PD-1臨床試驗的患者已接受過多種治療，這也許會改變PD-L1的表達水平。

多種腫瘤患者腫瘤內PD-L1表達提示較好的預后，如在CRC中，PD-L1高表達與pMMR、較早T分期、無淋巴結轉移、腫瘤低分化、無血管浸潤和較好的預后相關。這有悖於PD-L1的免疫抑制作用。這一現象的原因可能是:當腫瘤浸潤細胞毒性T細胞遇到抗原時PD-1表達上調並分泌干擾素γ(IFN-γ)，IFN-γ是CD8+T細胞輔助1的細胞因子，接著針對IFN-γ出現適應性免疫反應，附近的腫瘤細胞和浸潤性免疫細胞PD-L1表達上調。這種誘導PD-L1產生方式使這些細胞免受活化的PD-1+效應T細胞的攻擊。因此，PD-L1的表達可以看作是細胞毒性T細胞被激活開始抗腫瘤的標誌。

多項研究提示，PD-L1水平較高的腫瘤患者對抗PD-1—PD-L1軸治療反應更好。一項研究綜合分析多項報道發現，15種實體瘤對抗PD-1治療的平均反應率為29%，在PD-L1陽性腫瘤中平均反應率提高至48%，而PD-L1陰性腫瘤中僅為15%。雖然PD-L1表達與抗PD-1治療的長期療效如PFS和OS的相關性尚未明確，一些研究提示，PD-L1高表達預示更長的生存期。對於那些有多種可選擇治療方案的患者來說，PD-L1陽性患者可以考慮將抗PD-1—PD-L1軸治療作為一線治療，而PD-L1陰性患者可以考慮將抗PD-1—PD-L1軸治療作為二線及後續治療。

此外，還有研究發現，多個標誌物聯合應用，如聯合PD-L1表達水平、CD8+T細胞密度和IFN-γ通路相關標誌物可以有更好的預測價值。有趣的是，與PD-L1表達水平比較，淋巴細胞表達PD-1(抗PD-1治療的直接靶目標)似乎沒有更好的預測價值。目前，PD-L2的表達對於預測腫瘤預后及抗PD-1的療效未明。

總結

mCRC患者並不是腫瘤免疫治療中獲益最大的人群，但其應用前景值得期待。曹雪濤教授牽頭的DC-CIK聯合化療對比單純化療治療mCRC的Ⅱb/Ⅲ期全國多中心臨床研究正在進行中，TCR免疫細胞治療也值得期待，MSI-H患者接受抗PD-1單葯治療的臨床經驗正在積累之中。但是也有很多問題尚待明確和進一步研究，如抗PD-1和抗CTLA-4藥物有無協同作用，CPI治療與傳統化療、抗EGFR和抗VEGF靶向藥物如何合作，如何精準評價免疫治療的療效以及如何從分子檢測去預測或篩選有效患者。

節選自：實用腫瘤雜誌 2017 年第32卷第2期