走進細胞培養代謝副產物-NH4+

作者: 知行

細胞培養環境對單抗的產量和質量有著重大影響，如培養基成分、pH、DO、溫度等，另外對細胞具有毒性的代謝副產物乳酸和銨的累積同樣會影響細胞表現與抗體的產量和質量。培養基中乳酸的來源主要為葡萄糖的不完全降解，銨主要來自於谷氨醯胺的代謝降解和自發降解，當然其他一些氨基酸或血清成分的代謝也是銨的來源之一。眾多學者就銨的機理及對細胞的生長、蛋白產量與質量的影響均有研究，文中筆者就銨的毒性機理、對細胞及蛋白的影響、降低銨的措施等進行簡要概述。

毒性機理

1.胞內pH平衡

培養基、細胞質和線粒體內的氨(NH3)和銨離子(NH4+)之間一直處於一種動態平衡，它們之間的相互轉化受所處環境的pH影響，NH3和NH4+的動態平衡是調節胞內pH處於穩態的方式之一。NH3是一種不帶電荷、脂溶性的小分子，可通過自由擴散作用透過細胞膜，驅動力為膜兩側的濃度差；而NH4+的膜穿透速度卻是比較慢的，因為其只能在能量的作用下通過Na+K+ - ATPase、Na+K+2Cl-轉運蛋白等進出細胞膜，而且採用這種方式時NH4+需要與K+等離子競爭轉運蛋白上的結合位點，可能會破壞細胞膜上的離子動態平衡，影響胞內穩態。

一般情況下，外界環境、細胞質和線粒體內的NH3和NH4+處於動態平衡，NH3在膜內外的自由擴散對細胞內的pH進行微調，但基本處於一種平衡狀態，如圖1a所示。當向培養基中添加NH4Cl或者由於培養基中谷氨醯胺自發降解導致的NH4+增加時，如圖1b所示，在濃度梯度作用下NH3進入細胞內、線粒內及其他含膜細胞器內，從而使細胞內的pH上升，對酶活造成不利影響，從而會限制細胞生長和代謝。

圖1 NH3和NH4+對細胞內pH的擾動及其電化學平衡 (圖片來源於參考文獻1)

2.底物代謝循環

NH3和NH4+對細胞的影響還體現在代謝上，銨可以通過與酶的結合位點相互作用而影響酶活，例如對谷氨醯胺酶和谷氨醯胺合成酶的影響。谷氨醯胺酶催化谷氨醯胺降解形成谷氨酸和銨，谷氨醯胺合成酶使反應向相反的方向進行，有研究報道稱提高銨濃度可以刺激谷氨醯胺酶的活性，其具體機制還不明確。另外，谷氨酸在谷氨酸脫氫酶作用下的進一步降解時會產生氨和α-酮戊二酸，此過程需要NAD+的參與，如圖2所示，同時氨和α-酮戊二酸合成谷氨酸的反應可以一定地解除銨對細胞的毒性效應。

此外，糖代謝的關鍵酶磷酸果糖激酶(PFK)的活性也受銨影響，高濃度的銨會擾亂糖代謝途徑，導致乳酸濃度升高。還有研究發現，銨會促進細胞內UDP-N-乙醯半乳糖胺的合成，雖然作用機理還不明確，但高水平的UDP-N-乙醯半乳糖胺對細胞是具有毒性。由上可知，銨是底物代謝重要的參與者，同時也可影響部分酶的酶活，細胞培養過程中銨濃度失調對細胞生長的影響細胞是必然的。

圖2 谷氨酸脫氫酶作用下的谷氨酸降解與合成過程 (圖片來源於參考文獻1)

對細胞及蛋白的影響

1.細胞生長及代謝

通過外源性的添加NH4Cl，學者們就銨濃度增加對細胞的影響進行了研究，如圖3所示，Yang等發現細胞密度隨NH4Cl的增加而降低，與對照相比添加40mM的NH4Cl時細胞密度降低了56%, 而低濃度的NH4Cl (5mM之內)的對細胞的影響較小。

圖3 不同濃度的NH4Cl對CHO細胞的影響(圖片來源於參考文獻2)

同時研究人員還對葡萄糖和幾種氨基酸的比合成或消耗速率進行了測定，如下表所示，銨的添加增加了谷氨酸(glutamate)、丙氨酸(alanine)和甘氨酸(glycine)的合成速率，而加速了對葡萄糖和谷氨醯胺(glutamine)的消耗。銨濃度的提高不僅增加了細胞對能量的需求，還影響了細胞的代謝循環，進而影響細胞的正常生長。當然由於研究過程中採用的銨離子濃度往往超過細胞本身所產生的，並不能排除銨單一的對代謝影響的因素，還可能是胞內pH增加的原因。

(圖片來源於參考文獻2)

2.糖基化

細胞培養過程中高濃度的銨還會影響蛋白的糖基化水平，主要表現為降低糖鏈末端的唾液酸化水平、半乳糖苷化等。蛋白的糖基化過程發現在內質網和高爾基體內，有學者認為銨濃度的增加會增加膜類細胞器內的pH，進而降低糖基轉移酶和N-乙醯氨基葡糖轉移酶III/IV的活性；還有學者認為，銨的添加是通過擾動細胞的底物代謝平衡，而影響蛋白的糖基化水平。

Chen等就高濃度銨對CHO細胞糖基化的影響進行了研究，其通過定量PCR (QRT-PCR)技術對糖基化相關基因(14個基因)的擴增數進行了分析。將銨壓力下CHO細胞和對照組的基因表達相比，發現有5種基因的表達對銨敏感，包括：UDP-半乳糖轉運蛋白、β(1,4)-半乳糖基轉移酶、α(2,3)-唾液酸轉移酶、GMP-唾液酸轉運蛋白和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。如圖4所示，與對照相比添加銨的實驗組α(2,3)-唾液酸轉移酶和GMP-唾液酸轉運蛋白水平較低，這不僅會導致胞液中唾液酸向高爾基體的轉動量降低，還會影響糖鏈上的唾液酸連接，最終降低蛋白的唾液酸化。

數據也顯示，銨濃度增加時，β(1,4)-半乳糖基轉移酶基因的表達量也會降低，進而引起β(1,4)-半乳糖基轉移酶減少，影響半乳糖基化。雖然此時UDP-半乳糖轉運蛋白的表達會增加，但從沒報道過銨的添加會增加蛋白半乳糖化，其中的機制還需要更多的研究。而銨濃度對於UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的影響則會阻礙唾液酸的合成，及其向高爾基體的轉運，從而對唾液酸化產生不利影響。

圖4 α(2,3)-唾液酸轉移酶(α(2,3)-ST)和GMP-唾液酸轉運蛋白(GMP-SiaT)的表達水平比較(對照，三角形；銨壓力，正方形) (圖片來源於參考文獻3)

降低銨的策略

細胞培養過程中銨的來源有兩個途徑，一是谷氨醯銨(Gln)的自發化學降解，二是谷氨醯銨等氨基酸的代謝。為消除由於Gln自發降解產生的銨，限制培養基中Gln的添加濃度可以降銨的積累，另外可以用更為穩定的Gln派生物代替以減少其自發降解量，如甘氨醯谷氨醯胺。

大多數情況下，銨主要來源於谷氨醯胺酶作用下Gln轉化成谷氨酸(Glu)的過程，Gln自發降解產生的銨只佔極少一部分。如果將Glu，而不是Gln添加到培養基中便可有效的減少銨的生成，但同時也會在一定程度下降低細胞的生長速率。與Glu的出發點類似，其他氨基酸的添加也可降低銨的積累。Chen等進行了相關的研究，其通過外源性添加10mM NH4Cl到培養基模擬高濃度銨離子，並在此條件下測定了不同種氨基酸對細胞生長的影響。實驗得出蘇氨酸(threonine)、脯氨酸(proline)和甘氨酸(glycine)可以抑制高濃度銨對細胞的毒性，與對照相比，分別使細胞終密度提高了15%、20%和25%，如圖5所示，其中絲氨酸(alanine)的添加作用負對照。對添加銨的實驗組中對照組與蘇氨酸、脯氨酸和甘氨酸實驗組的代謝參數比較，發現氨基酸組的銨濃度要比對照組低，同時其谷氨醯胺濃度也要高些，而葡萄糖消耗和乳酸生成均要低些，這就說明三種氨基酸的添加促進了細胞的碳代謝與氮循環，從而促進細胞生長。

圖5 氨基酸對高濃度銨離子添加培養基中細胞密度的影響 (圖片來源於參考文獻4)

優化細胞培養策略也可以降低銨的累積，例如對谷氨醯胺和葡萄糖的補料方式及補量進行優化，以其他糖類代替葡萄糖，如半乳糖、甘露糖、果糖等，主要是通過對細胞代謝路徑的調控來減少銨累積。採用物理移除培養系統中的銨也是一種選擇，例如透氣型、疏水多孔膜，離子交換膜或離子交換樹脂和電滲析等方法，然而這些方法只有應用於產生大量銨離子的高密度細胞培養中才能體現對活細胞密度和抗體濃度的改善。

細胞培養時代謝廢物銨的累積不僅會影響細胞的表現，還會對抗體的糖基化產生影響，追問其機理可能與細胞胞內的pH平衡破壞與酶活下降有關。但是，對谷氨醯胺和葡萄糖的補料策略進行優化，或者採用其他氨基酸代替谷氨醯胺等均可控制銨的累積。