piRNA與腫瘤研究進展

piRNA與腫瘤研究進展

導語

近年來piRNA在癌症基因組中作用正成為研究熱點。最初發現piRNA對生殖相關時間發揮重要作用，在人類基因組中已經發現超過20000個piRNA。與miRNA相比，piRNA與PIWI蛋白相互作用，初始功能發生在細胞核內，PIWI是Argonuate蛋白家族的成員之一。PIWI/piRNA 通過表觀遺傳水平和轉錄后水平沉默轉座子等自私性遺傳元件，維持生殖細胞基因組的穩定性和完整性。PIWI/piRNA 還可以通過轉錄后水平調控蛋白質編碼基因。最近研究發現piRNA組織特異性在人的各種體細胞組織中表達。越來越多的研究表明piRNA異常表達是多種類型腫瘤的標誌性特徵，然而它們特定致癌功能仍不清楚。本文討論piRNA起源、機制、功能以及在腫瘤中的作用及其臨床應用的潛力。

非編碼RNA類型和功能的多樣性

小非編碼RNA的RNA長度在20-35bp，包括微小RNA（microRNAs,miRNAs）,源於核糖體RNA片段（tRNA-derived fragment，tRF),PIWI蛋白作用RNA（PIWI-interacting RNAs ，piRNAs），核仁小分子RNA（C/D snoRNA-derived RNA,sdRNA）和小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs）。

長鏈非編碼RNA長度在200bp以上，包括啟動子相關長鏈RNA（promoter associated long RNAs ，PARs），轉錄超保守區域（transcribed ultraconserved

regions ，T-UCR），長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs ，lncRNAs），假基因（pseudogenes），反義RNA（antisense RNA,asRNAs）

以上主要以RNA分子大小為分類依據，其中紅色標記piRNA比一般的小RNA略長，在細胞質和細胞核的功能十分活躍。

piRNA發現

piRNA的發現為非編碼小分子RNA的研究開闢了一個新領域，被Science評為2006年十大科技進展之一。2006年，四個獨立的研究小組幾乎同時在果蠅、小鼠、大鼠和人等物種生殖系細胞中發現了一類特異地與PIWI家族蛋白質相互作用的新型小分子RNA。

AravinA，GaidatzisD，PfefferS，etal．《A novel class of small RNAs bind to MILI proteinin mouse testes》．Nature，2006，442（7099）：203～207

Aravin等發現了該種小RNA，他們在3個月大的C57BL/6J雄性小鼠中從小鼠全睾丸組織的全細胞裂解液中利用免疫共沉澱技術純化並獲得MILI核糖核蛋白複合體。該複合體中含有

26-28nt RNA進行凝膠純化，克隆和測序。他們根據Piwi蛋白家族的成員MILI與這些小RNA的相互作用，命名為Piwi interacting RNAs，即piRNAs。

GirardA，SachidanandamR，HannonGJ，etal．《Agermline specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins》．Nature，2006，442（7099）：199～202

Girard等在睾丸總RNA分離過程中也檢測到了這種小RNA，它與MIWI蛋白（一種鼠科的Piwi蛋白）結合。他們用小鼠17號染色體，大鼠20號染色體和人的6號染色體進行分析，發有類似的piRNA，大多數基因簇出現在同線位置上。

LauNC，SetoAG，KimJ，etal．《Characterization of the piRNA complex from rattestes》．Science，2006，313（5785）：363～367

GrivnaST，BeyretE，WangZ，etal．《A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cells．Genes&Dev，2006，20（13）：1709～1714

此外，相繼有3篇文章也分別報道了在小鼠的生精細胞、生殖系細胞以及睾丸中發現了piRNA

其中日本的實驗室根據來源將其命名為germline small RNA（gsRNA），由於命名原則的不同，故在名稱上存在一定的差異。

piRNA的起源

Yuka W. Iwasaki,Mikiko C. Siomi,and Haruhiko Siomi,《PIWI-Interacting RNA: Its Biogenesis and Functions》，Annual Review of Biochemistry，2015，Vol. 84: 405-433

piRNA 來源於基因組中的piRNA 簇(piRNA cluster) 或轉座子區域，由長的單鏈轉錄本切割產生。成熟的piRNA 24-32 nt。之前的研究使人們對piRNA 的生物發生有了較深入的了解。piRNA 在動物界廣泛表達，目前尚未在植物中檢測到。除線蟲外，從海綿動物(sponges) 到高等哺乳動物中保守存在兩條piRNA 生成途徑：

初級生成途徑（primary pathway）：初級生成途徑主要發生在體細胞中，主要由單鏈piRNA 簇、雙鏈piRNA簇、基因來源的piRNA和轉座子來源的生成途徑。單鏈的piRNA前體加工成piRNA中間體後於Piwi蛋白結合發生細胞核或者細胞質沉默事件。

次級生成途徑（secondary pathway）：初級生成途徑主要發生在生殖細胞中，PIWI 家族在果蠅中有3 個成員——Piwi、Aub和Ago3，其中Piwi 和Aub 結合初級piRNA。由初級加工途徑生成的Aub-piRNA 大多來源於轉座子的反義鏈，可以通過序列互補配對識別正義鏈的轉錄本，然後由Aub 切割形成次級piRNA 的5' 端，並裝載到Ago3 上，再通過與初級加工途徑類似的3'端修剪、甲基化修飾等過程得到正義鏈來源的次級piRNA。Ago3- 次級piRNA 複合物再以同樣的機制剪切產生反義鏈的Aub- 次級piRNA，即被稱作乒乓循環(ping-pang cycle)的piRNA 次級加工途徑。小鼠睾丸中同樣存在由Mili 和Miwi2介導的乒乓循環。事實上，已有研究報道次級通路在多種脊椎動物，甚至是無脊椎海綿動物中保守存在，提示這一過程具有重要的生物學意義。目前認為，來源於piRNA基因簇的初級piRNA 可以廣譜靶向細胞中的各種遺傳元件，而次級通路則針對有活性的轉座子序列擴增特異性的piRNA，發揮沉默轉座子的作用。

piRNA的結構特徵

piRNA是一類長度為26～31nt單鏈的小RNA，大部分集中在29～30nt，與miRNA和rasiRNAs一樣，5′端也具有強烈的尿嘧啶傾向性（約86%）。

piRNA 3'末端的2'氧甲基化修飾，文獻報告修飾被PIWI蛋白的PAZ結構域識別，具體機制不太明晰。

piRNA無明顯特殊性的二級結構特異基序和特徵。

piRNA在染色體上的分佈極不均勻，在小鼠中它們主要分佈於17、5、4、2號染色體上，而很少分佈於1、3、16、19和X染色體上，基本不分佈於Y染色體上。

piRNA主要存在於基因間隔區，而很少存在於基因區或重複序列區。它們主要成簇分佈在1～100kb相對較短的基因組位點，且包含有10～4500個小分子RNA。由於piRNA成簇分佈，且每一個幾乎都具有同一取向，說明同一簇piRNA可能來源於同一長初始轉錄物，但有一部分成簇的piRNA會突然改變取向，說明這些雙向的成簇piRNA可能由相同的啟動子按不同的方式轉錄而來。

miRNA與piRNA特性比較

Betel D, Sheridan R, Marks D S, et al.《Computational analysis of mouse piRNA sequence and biogenesis》. PLoS Comput Biol, 2007, 3(11): e222.

piRNA生物學功能

A.piRNA調控果蠅早期胚胎髮育

2001年，Aravin 等發現，果蠅Y 染色體上與Stellate同源的假基因Su(Ste) 編碼一類小RNA，其長度大於siRNA，與PIWI 家族蛋白Aub 相互作用，即現在熟知的piRNA。Su(Ste)基因缺失或aub突變即檢測不到Su(Ste) 來源的piRNA，同時導致Stellate蛋白積累、果蠅雄性不育。後續的研究發現，Aub-Su(Ste)piRNA通過在轉錄后水平降解成熟的mRNA，實現對Stellate基因表達的負調控。

B.piRNA參與家蠶性別決定

家蠶piRNA的最新研究發現，來自性染色體的FempiRNA通過直接切割靶mRNA參與性別決定。家蠶採用ZW性別決定系統，即雄性攜帶兩條Z染色體，而雌性攜帶1條Z染色體和1條W染色體。決定性別的W染色體幾乎全部為轉座子序列，至今未鑒定出蛋白質編碼基因。W染色體的轉錄本可以作為piRNA前體，加工成29nt的Fem piRNA，在雌性家蠶中特異性表達。在家蠶胚胎中轉染Fem piRNA的反義鏈RNA或通過siRNA下調家蠶PIWI蛋白Siwi表達，均導致雌性家蠶出現雄性化特徵。

C.piRNA介導mRNA衰減

《PIWI/piRNA調控基因表達研究的新進展》DOI: 10.13376/j.cbls/2015046

2010 年，Rouget等報道發現果蠅piRNA參與早期胚胎中母源mRNA 的降解。胚胎髮育早期，隨著早期胚胎轉錄機器的啟動，母源mRNA逐漸被胚胎mRNA 取代，被稱作母源-合子過渡(maternal-to-zygonic transition)。過渡過程中，母源mRNA 的降解通過CCR4-NOT脫腺苷酸複合物介導。

D.piRNA調控基因表達的機制

對線蟲piRNA (21U-RNA)的一系列研究，揭示了piRNA 在基因表達調控中的雙重功能。線蟲piRNA 由單個的轉錄小單元編碼，其序列可覆蓋幾乎所有的蛋白質編碼基因。線蟲piRNA 執行生殖細胞的全基因組轉錄本監測任務，一方面通過可遺傳的RNA 誘導的表觀遺傳沉默途徑(RNA-induced epigenetic silencing pathway, RNAe) 沉默外源的「非我」(non-self) 基因；一方面保護內源基因mRNA的穩定性，並激活其表達。21U-RNA 載入到線蟲PIWI 蛋白PRG-1 上，通過序列不完全互補配對識別靶mRNA，招募RNA 依賴的RNA聚合酶(RdRP)合成與mRNA 完全互補配對的22G-RNA。22G-RNA 可以與兩種Argonaute 蛋白結合，與WAGO蛋白結合則招募組蛋白甲基轉移酶啟動RNAe，抑制外源mRNA 表達；與CSR-1 結合則保護內源靶mRNA 不受RNAe沉默，並激活其表達。21U-RNA對基因表達雙向調控的確切機制還有待於進一步的研究。

D.piwi-piRNA在果蠅中調控表觀遺傳沉默

E.piRNA調控轉座

轉座元件是一類存在於多細胞生物基因組中的不穩定元素，它們可以通過頻繁跳躍將自身插入到基因組的其它位點，從而實現對基因結構和表達的改變，對物種進化具有重要意義。然而，如果轉座元件在基因組中毫無約束地隨意移動，則會破壞基因組的穩定性和完整性，危害個體的生存。因生殖細胞擔負著傳代的重任，其基因組的穩定性和完整性尤為重要。因此，在選擇壓力下，動物生殖系細胞可能就進化獲得了PIWI/piRNA這樣一條獨特小RNA通路，用於控制轉座子、逆轉座子等自私性基因元件的活性，維持生殖細胞基因組穩定性及完整性。

piRNA生物學功能核心組件PIWI蛋白

Argonaute蛋白家族可分為AGO和PIWI兩個亞家族成員，它們在物種間高度保守，並在小分子非編碼RNA調控途徑中發揮核心作用。其中AGO蛋白質成員特異性地與小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA) 和microRNA(miRNA)結合，在多種組織器官中發揮重要功能。而PIWI蛋白質特異性地在動物生殖系細胞中表達，特異性地結合piRNA，在動物生殖細胞發育和配子生成過程中發揮多種重要功能。

Argonaute家族蛋白質含有保守的PAZ(Piwi Argonaut and Zwille)結構域和PIWI結構域。結構及生化研究表明，AGO/PIWI蛋白質通過PAZ結構域與小分子RNA的3′末端結合，而PIWI結構域及MID結構域(the middle domain)結合RNA分子的5′末端。PIWI結構域含有RNase H的催化結構域，一部分Argonaute 成員具有核酸內切酶活性，可在對應於嚮導小RNA分子第10位與11位鹼基之間切割靶RNA鏈piwi是進化上非常保守的一類基因，最早在果蠅中被發現，對果蠅生殖幹細胞的自我更新和維持是必需的。隨後，研究人員通過功能缺失突變實驗發現，piwi基因缺失也導致線蟲、斑馬魚及小鼠等模式生物生殖細胞發育受阻。這些研究表明，PIWI蛋白主要在動物生殖細胞中表達，其功能與生殖事件相關。

在小鼠中，PIWI蛋白家族包括三個成員：MIWI2、MILI和MIWI，它們在小鼠雄性生殖細胞的發育分化過程中呈現高度時空特異性表達。

Piwi類系物表達

piRNA在腫瘤中的研究迎來井噴

從2006年發現piRNA開始piRNA研究趨勢很明顯，文獻發表數量急劇增加。

piRNA在體細胞中表達具有組織特異性

在乳腺，肺和胃組織中進行piRNA測序和表達譜分析，發現piRNA具有組織特異性。

piRNA在腫瘤中異常表達

piRNA與臨床

Piwi相互作用RNA（piRNA）是一類新發現的非編碼小RNA，又稱第三類小RNA。它們具有基因表達調控的功能，但與腫瘤發生、發展的關係非常仍然不太清晰。寧波大學郭俊明在胃癌中

（1）發現了在胃癌組織中異常表達的piRNA。經piRNA晶元檢測胃癌組織和癌旁組織中piRNA的表達，發現一些差異表達的piRNA，其中piR-651和piR-823的表達差異具有統計學意義。

（2）揭示了胃癌組織與癌旁組織piRNA表達譜的差異。發現胃癌組織中piR-823的表達水平明顯低於癌旁組織中的表達水平，而piR-651的表達則相反。發現piR-651和piR-823分別高表達於和低表達於胃癌組織中，並於胃癌患者的臨床病理因素相關。

（3）胃癌細胞株與正常胃上皮細胞中piR-823表達差異的研究。發現胃癌細胞中piR-823的表達明顯低於正常胃上皮細胞中的表達。

（4）多種腫瘤組織中piR-823表達差異的研究。發現，結腸癌和肺癌組織中，piR-823的表達高於相應癌旁組織。

（5）piR-823類似物抑制胃癌細胞的生長。把piR-823類似物導入到胃癌細胞中，MTT結果顯示MGC-803和SGC-7901的生長均以劑量依賴方式受到抑制。

（6）piR-651抑製劑通過影響細胞周期抑制胃癌細胞的生長，機制研究說明其阻止胃癌細胞於G2/M期。

（7）動物實驗說明piR-823具有抑制腫瘤細胞生長的作用。

（8）外周血piRNA檢測用於胃癌診斷的價值研究。胃癌患者外周血piR-651和piR-823的水平明顯不同於正常人外周血中的水平；腺癌患者外周血piR-651的水平明顯高於印戒細胞癌的水平；piR-823 的水平與TNM分期和遠處轉移有關。piR-651、piR-823單獨使用和聯合使用的ROC曲線下面積分別為0.890、0.810和0.892；它們的陽性檢測率均高於CEA的檢測率。

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