流式細胞術在評價免疫功能中的應用
吳瑩瑩，司少艷，解放軍306醫院，特種醫學實驗研究中心
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一、流式細胞術簡介
1、概念。流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是一種能夠同時檢測、分析單個微粒（細胞、微生物及人工合成的微球）的多項物理及生物學特性，並加以定量的技術，同時可以對特定群體加以分選。
2、FCM的特點。(1)快速：最快可在1秒鐘內計測數萬個細胞；(2)可進行多參數測量：可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數測量，並具有明顯的統計學意義；(3)一門綜合性的高科技方法：它綜合了激光技術、計算機技術、流動力學、細胞化學、圖像技術等多領域的知識和成果；既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。
3、流式細胞術的原理。讓熒光染色的細胞在穩定的液流推動裝置作用下，通過直徑為50-100μm的小孔並排列成單行，每個細胞依次而且恆速通過激光束的照射區，細胞受激光照射后產生散射光和熒光。通過檢測散射光可知細胞的體積和胞內顆粒物，檢測熒光可知細胞被熒光素所標記物質的含量。根據所規定的參量可把指定的細胞亞群從整個群體中分選出來，以便進一步的研究分析。
4、流式細胞儀分析的參數。(1)前向角散射（forward scatter，FSC）：強度與細胞的大小有關，即FSC強，細胞大，FSC弱，則細胞小。(2)側向角散射（side scatter，SSC）：又稱90°散射或大角散射。與細胞膜、細胞質、核膜的折光率，以及胞內顆粒的大小有關。因此，側向角散射光的強弱可反應細胞內精細結構和顆粒的性質。(3)熒光強度（fluorescence intensity，FL）：通過熒光強度可以將同一個細胞群體中的陽性細胞（熒游標記）與陰性細胞（無熒游標記）區分開來，也可以將強陽性細胞（高FL）與弱陽性細胞（低FL）區分開來。(4)同時分析多種熒游標記：細胞上的熒光染料被激光激發后發射出熒光，不同的熒光染料發射波長不同。大型的流式細胞儀裝有三個激光光源（488nm、633nm和407nm），可同時檢測13種熒光。
5、流式細胞術的應用。(1)科研中的應用：檢測細胞周期、檢測細胞凋亡、檢測細胞增殖、檢測細胞吞噬功能、幹細胞研究、檢測基因表達等。(2)臨床應用：免疫細胞亞群檢測、檢測細胞因子、白血病和淋巴瘤的免疫分型、血小板分析等。
二、流式細胞術在評價免疫功能中的應用
1、外周血淋巴細胞亞群分析
(1)外周血白細胞分類。
(2)外周血淋巴細胞亞群分類及功能。根據功能，淋巴細胞主要分為T淋巴細胞（與細胞免疫有關）、輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、B淋巴細胞（與體液免疫有關）、NK細胞（能夠直接殺傷某些腫瘤細胞和病毒感染的細胞）。
(3)外周血淋巴細胞亞群流式分析。
(4)淋巴細胞亞群的臨床應用。通過淋巴細胞亞群的檢測可了解在不同情況下體內免疫功能狀態，輔助臨床疾病的診斷，探索疾病發病機理、病程、預后，監測、指導臨床治療方案。
(5)T和B淋巴細胞的臨床意義。T淋巴細胞上升多見於慢性活動性肝炎或慢性遷延性肝炎、器官移植排斥反應、重症肌無力、甲亢與甲狀腺炎患者。T淋巴細胞下降多見於惡性腫瘤、自身免疫性疾病（如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎）、原發性免疫缺陷病（如生天性胸腺發育不全、艾滋病）、接受放療、化療或者使用腎上腺皮質激素等免疫抑製劑。B淋巴細胞上升多見於多發性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淋巴瘤、艾滋病。B淋巴細胞下降多見於原發性免疫缺陷病、如性聯無丙種球蛋白血症等、惡性腫瘤。T淋巴細胞與B淋巴細胞同時下降多見於聯合免疫缺陷病、如重癥狀聯合免疫缺陷病等。
(6)Th/Ts比值的臨床意義。CD4+/CD8+的比值：評價自身免疫失調或被懷疑是免疫失調或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態，此外，這一比值還可用來監測骨髓移植病人，以免受到急性GVHD的攻擊。CD4/CD8升高：自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎、SLE。CD4/CD8 降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血等。
(7)自然殺傷細胞（NK）的臨床意義。NK細胞增高常見於某些病毒感染性疾病的早期、長期使用干擾素或使用干擾素的誘導物、骨髓移植后、習慣性流產。NK細胞降低常見於惡性腫瘤，特別是中晚期或伴有轉移的腫瘤、免疫缺陷病及使用腎上腺激素等免疫抑製劑、部分病毒感染、細菌感染及真菌感染、某些白血病及白血病前期。
2、外周血Th1、Th2、Th17和Treg細胞分析
(1)Th細胞分化及功能。輔助性T細胞是T淋巴細胞的一個亞群，當受到不同的協同刺激和細胞因子信號時，輔助性T細胞會分化成Th1、Th2、Th9、Th17、Tfh、Treg等細胞。分化的Th細胞亞群會分泌不同的細胞因子，行使不同的功能。
(2)Th1、Th2、Th17檢測原理。(a)活化：自然狀態下，靜止的淋巴細胞不分泌或者分泌極少量細胞因子，刺激激活后，細胞內的細胞因子合成增加。常用的刺激劑有佛波酯PMA、離子黴素（Inomycin）、ConA、PHA、LPS等。(b)抑制分泌：細胞因子合成后很快就主動分泌到細胞外，位於細胞內的細胞因子的量很少，一般無法達到流式分析檢測的最低標準，因此必須阻止細胞因子分泌到細胞外。蛋白質分泌抑製劑如莫能黴素（monensin）、BFA（brefeldin A）能抑制細胞因子分泌，使其累積在細胞內。(c)標誌物：IFN-γ、IL-4、IL-17A分別為Th1、Th2、Th17的特徵性細胞因子，同時標記CD4分子。
(2)Treg細胞的檢測原理。CD4+ CD25+ Foxp3+是Treg細胞的表面標誌。
(3)Th1、Th2、Th17、Treg臨床意義。(a)Th1細胞主要介導細胞免疫應答，通過募集並活化巨噬細胞而引發遲髮型超敏反應性炎症；Th2細胞可輔助B細胞產生不同類別抗體，主要介導體液免疫應答；Th17主要介導炎症反應；Treg是一類具有免疫抑制作用的T細胞，不僅參與自身免疫耐受調節，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。(b)Th亞群細胞因子平衡對人體正常生理功能的維持發揮重要作用，細胞因子分泌失調會導致各種疾病的發生，將細胞因子調節到平衡狀態是治療這些疾病的重要手段。
【解放軍306醫院開展淋巴細胞亞群檢測】
解放軍306醫院特種醫學實驗研究中心自2003年開始，採用流式細胞術開展了外周血淋巴細胞亞群檢測，隨後開展了Th1、Th2、Th17、Treg的檢測，至目前為止已出具數萬份檢測報告，為評估患者的免疫功能，判斷患者病情，輔助臨床醫生制定治療方案均提供了重要的依據。