一株豬源大腸桿菌的分離鑒定和葯敏試驗研究
豬是大腸桿菌的易感群體，大腸桿菌常引起仔豬黃痢、仔豬白痢和斷奶仔豬水腫病，通常情況下大腸桿菌病的發病率和死亡率均較高，是一類重要的人畜共患病。隨著我國養豬規模的不斷發展，該病的發病率及死亡率也逐年提高，並且逐漸由條件性疾病演變為常發性疾病，嚴重阻礙了養豬業的健康、快速發展。此外，由於抗生素的大量使用，大腸桿菌的耐葯譜和耐藥水平不斷提高，大腸桿菌的耐藥性越來越嚴重。針對這種情況，筆者進行了豬源性大腸桿菌的分離鑒定及葯敏試驗研究，以期解決貴州某豬場在治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的藥物選擇問題，避免盲目使用或濫用抗生素類藥物而產生耐藥性。豬病臨床表徵見圖1和圖2。
圖1 15 日齡仔豬臨床表現
圖2 2月齡發病仔豬表現
1、病料
病料為貴州省福泉市某豬場病死仔豬的肝臟、肺臟、直腸棉拭紙等。病豬剖檢情況見圖3。
圖 3 發病仔豬剖檢情況
2、方法
▌ 2.1 細菌的分離與純化
無菌採集病料，接種於普通LB瓊脂培養基、SS瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基進行培養。
▌2.2 細菌的革蘭氏染色
在一乾淨的載玻片上滴加10µL三蒸水，用接種環挑取已純化培養的單個菌落，與載玻片上的三蒸水充分混勻，用酒精燈進行火焰固定或自然風乾，然後進行革蘭氏染色，待染色區域風乾后，於油鏡下觀察細菌的染色情況和形態。
▌2.3 細菌的生化試驗
挑取純培養的菌落接種於細菌微量生化鑒定管進行鑒定。
▌2.4 分離菌株16S rRNA基因擴增
以分離菌株的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA基因的通用引物進行PCR擴增，預擴增片段為1 492bp。PCR反應結束后，取PCR產物5µL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段膠回收後送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，對測序結果進行核苷酸同源性的比較及系統進化樹的構建。
▌2.5 分離菌株的葯敏試驗
挑取LB瓊脂培養基上的單個菌落於LB液體培養基中增菌培養，約12 h后取0.5mL菌液均勻塗佈於LB瓊脂培養基表面，待菌液吸收后貼上慶大黴素、青霉素、鏈黴素、氨苄西林、環丙沙星、多西環素、阿莫西林、卡那黴素、磺胺甲基異噁唑、頭孢曲松、氧氟沙星等11種葯敏紙片，置37℃培養箱中培養12～16 h，觀察結果，並用直尺測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小判定細菌對藥物的敏感性。
3、結果與分析
▌3.1 分離菌株的菌落形態觀察
分離菌株在LB瓊脂培養基上形成圓形、凸起、光滑、灰白色、半透明的菌落，直徑為2～3mm，見圖4A；在伊紅美藍瓊脂培養基上形成圓形、表面光滑、稍凸起、邊緣整齊、紫黑色並帶金屬光澤的菌落，見圖4B；在SS瓊脂培養基上形成圓形、光滑、稍凸起、邊緣整齊、粉紅色的菌落，見圖4C；分離菌株菌落經革蘭氏染色為紅色、兩端鈍圓的直桿狀，大小為2～5µm，見圖4D。3種培養基上的菌落形態及革蘭氏染色結果與大腸桿菌的基本特性相符。
圖4 分離菌株的形態學觀察結果（10×100）
▌3.2 分離菌株的生化鑒定
分離菌株能發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖和甘露糖，尿素酶、山梨醇、賴氨酸脫梭酶、吲哚試驗、甲基紅試驗結果均為陽性，V-P試驗、衛矛醇試驗、KCN試驗、H2S試驗及枸櫞酸鹽試驗結果均為陰性，以上生化鑒定結果參考《伯傑氏細菌鑒定手冊》上的判斷標準，與大腸桿菌的生化特性基本相符。
▌3.3 分離菌株的16S rRNA基因鑒定
用細菌16S rRNA基因的通用引物擴增目的序列，擴增的片段大小與預期目的片段1 492bp接近。將分離菌株的目的片段膠回收後送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，結果表明：分離菌株與NCBI上的大腸桿菌菌株的同源性為99.5%～99.9%；且與大腸桿菌菌株84（登錄號為MF399285.1）在同一遺傳進化分支上，與未鑒定的菌株E6aB04（登錄號為DQ103622）親緣關係較遠。
▌3.4 葯敏試驗
分離菌株對卡那黴素、環丙沙星、氧氟沙星高敏，對頭孢曲松中敏，對阿莫西林、氨苄西林、鏈黴素、磺胺甲基異噁唑、多西環素、慶大黴素、青霉素等不敏感。
4、討論
大腸桿菌血清型很多，且具有較強的地域性分佈，弄清各地致病性大腸桿菌的優勢血清型及敏感藥物，對於該病的區域性防治具有重要的指導意義。在臨床實踐中可以根據葯敏試驗結果挑選有效抗生素，並注意交叉用藥，用量適當，儘可能控制和減少耐藥性的產生，提高抗生素對豬大腸桿菌病的防治效果。
劉米山從江蘇省泰州地區16個豬場採集40頭腹瀉仔豬的病料中分離出38株大腸桿菌，藥物敏感性試驗結果表明，26株致病菌對16種抗菌藥物的敏感性各異，其中90%以上的菌株對頭孢噻呋高度敏感，可以作為臨床用藥的首選參考。焦鳳超等從河南省羅山縣某豬場腹瀉仔豬肝臟分離到1株大腸桿菌，葯敏試驗結果顯示，分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻呋、頭孢噻肟和丁胺卡那等藥物高度敏感，對四環素、強力黴素、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星等藥物產生耐藥性。
本試驗從貴州省福泉市某豬場分離菌株與NCBI上的大腸桿菌菌株的同源性為99.5%～99.9%，且與大腸桿菌菌株84（登錄號為MF399285.1）在同一遺傳進化分支上，與其他未鑒定的菌株E6aB04（登錄號為DQ103622）親緣關係較遠。該菌株對卡那黴素、環丙沙星和氧氟沙星高度敏感，對頭孢曲松中度敏感，對阿莫西林、氨苄西林、鏈黴素、磺胺甲基異噁唑、多西環素、慶大黴素、青霉素等敏感度低或不敏感，由於該豬場用過泰樂菌素、氟苯尼考、氨苄西林、阿莫西林等抗生素，故對氨苄西林、阿莫西林等抗生素產生了耐藥性。
作者 | 石遠菊 湯德元* 曾智勇 王 彬 黃 濤
胡玲玲 龍冬梅 楊 偉 葉 麗 郭倩妤 廖少山
貴州大學 動物科學學院
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