環狀RNA結合miRNA研究不得不看的文章

研究環狀RNA跟miRNA的相互調控關係，思路不難，但工作量卻比miRNA要大許多，今天還是以Hansen的經典nature文章來闡釋其研究思路，理清思路做實驗時才容易做到心中有數。

一、生物信息學分析

預測circRNA序列是否存在miRNA的結合位點，以及對結合位點保守性分析。下圖ciRS-7為環狀RNA，存在大量miR-7的保守性結合位點。

不同物種中ciRS-7序列的保守性分析，miR-7和miR-671結合位點定位示意圖

CiRS-7序列採用MEME（基於motif序列元件分析）演算法，發現與miR-7結合位點處，中間鹼基無互補配對，而miR-671幾乎完全互補配對。RNA雙鏈中間區鹼基非互補配對可阻止miRNA介導的核酸內切作用。此處可參考另一篇文獻（證明miR-671通過AGO依賴方式內切circRNA的作用）。

MiR-671與ciRS-7結合的熱力學動態值低，形成的RNA雙鏈穩定性更高。

我們知道miRNA通常是經過AGO蛋白介導靶向結合到靶基因位點發揮抑制或降解效果。因此研究者進一步通過在線AGO的HITS-CLIP資料庫，分析ciRS-7處miRNA結合位點保守性情況，該實驗原理是，通過AGO抗體pulldown拉下AGO蛋白複合物，再高通量測序與AGO結合的miRNAs分子，理論上可全基因組定位miRNA的結合位點。上面B圖可以看出AGO拉下的序列不完全匹配到到ciRS-7基因組側翼序列上，提示為ciRS-7環化后造成的結果。

二、構建環狀RNA ciRS-7的過表達載體

c圖northern blot實驗檢測ciRS表達載體成環效果，d圖環狀RNA與miRNA過表達載體共轉染HEK293細胞，northern blot實驗檢測，可以看出線性ciRS-7載體在miR-7共轉染下，表達northernblot結果降低，環化ciRS-7表達幾乎不受影響。說明，ciRS-7存在miR-7結合位點，且環化的ciRS-7的表達不受miR-7抑制，也表明ciRS-7不會因miR-7靶向互補結合而通過AGO途徑抑制或降解。環狀RNA載體構建是circRNA研究中必不可少的一步，也是基本功，但circRNA本身環形結構的特殊性在載體構建過程中設計操作不當很容易出現不能成環或成環效率不高，還有出現插入缺失鹼基等情況出現。目前國內可提供環狀RNA過表達載體的公司還很少，廣州吉賽生物在circRNA研究方面起步早，目前已經構建鑒定了上百circRNA過表達載體，構建的環狀RNA表達載體pCD-ciR加入了兩個特製的環化表達框架，使環狀RNA連入載體后能在體外高效率表達，並保證插入的目的環狀RNA片段正確環化。表達框架中間插入KpnI和BamHI酶切位點，可直接通過酶切連接插入目的環狀RNA片段，已經推出三種circRNA過表達載體，真核過表達載體pCD-ciR、慢病毒過表達載體pLO-ciR、慢病毒過表達載體pLCDH-ciR（帶GFP標記）滿足不同的科研需求。

三、證明circRNA-AGO-miRNA形成複合物

AGO2免疫共沉澱實驗：HEK293細胞中共轉染myc-AGO2和miR-7,免疫共沉澱拉去AGO2后檢測ciRS-7表達水平，發現AGO2、miR-7和ciRS-7可能形成三元複合物。

生物素標記miRNA共沉澱實驗：製備生物素標記miR-7雙鏈miRNA轉染HEK293細胞，然後生物素抗體免疫共沉澱拉取miR-7複合物后，qPCR檢測ciRS-7表達，證明miR-7可結合ciRS-7。

RNA-FISH實驗驗證ciRS-7和miRNA共定位，ciRS-7和miRNA過表達細胞中免疫熒光探針檢測兩者的表達定位。

四、熒光報告系統驗證環狀RNA與miRNA直接結合證據

將ciRS-7線性序列構建至螢火蟲熒光素酶報告載體中，與ciRS-7及miR-7共轉染細胞，觀測螢光值變化。發現ciRS-7可挽救miR-7對線性ciRS-7熒光抑制效果。證明ciRS-7及miR-7可結合。

五、驗證環狀RNA對下游miRNA靶基因的調控

考察ciRS-7對miR-7下游靶基因表達的影響，構建環狀RNA過表達載體轉染細胞，不同濃度miRNA-7轉染細胞后，檢測miR-7下游靶基因的mRNA表達水平，可以看出，想對與circRNA的空載對照組，ciRS-7可以解除miR-7對下游靶基因的抑制效果。

作者來源：「circRNA」微信公眾號，吉賽生物

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