CAR-T 細胞療法的發展歷史

早在二十世紀初，科學家就發現T 細胞可以高效地殺傷腫瘤細胞，並嘗試了使用各種方法增強人體內T細胞到達腫瘤部位、識別腫瘤細胞的殺傷能力。

隨後，發展於1950年代的骨髓移植技術奠定了腫瘤細胞療法的基礎。這是現代醫學第一次通過輸入外源細胞來控制血液腫瘤的嘗試。

1987年，以色列免疫學家Zelig Eshhar, 發明了世界上首個嵌合抗原受體（CAR），並通過實驗證明，經過基因改造后表達CAR 的 T細胞由於具有來源於抗體的抗原識別片段，當接觸到腫瘤細胞后，可以迅速被激活，大量增殖併發揮腫瘤細胞殺傷功能。

更神奇的是，研究發現這種T細胞可以在人體內存在數年，隨時準備對表達抗原的腫瘤細胞發起進攻。

從1980年代開始，科學家開始通過各種臨床前和臨床實驗探索CAR-T細胞療法用於腫瘤治療的可能性，其中的先驅包括美國國家癌症研究所的Steven Rosenberg 博士，賓夕法尼亞大學的Carl June 博士，以及斯隆·凱特琳癌症中心的Michel Sadelain博士等。

圖2. 美國國家癌症研究所的Steven Rosenberg 博士，賓夕法尼亞大學的Carl June 博士，以及斯隆·凱特琳癌症中心的Michel Sadelain博士

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CAR-T細胞療法首次在Steven Rosenberg博士主導的晚期濾泡淋巴瘤病人的治療研究中取得了成功。

隨後，2011年，賓夕法尼亞大學的David Porter 博士報道，兩位經CAR-T細胞療法治療的慢性淋巴細胞白血病（CLL）病人實現完全緩解(數據來源：The New England Journal of Medicine，DOI: 10.1056/NEJMoa1103849)。

近乎同時，賓夕法尼亞大學、斯隆·凱特琳癌症中心、美國國家癌症研究所報道CAR-T療法在各自的兒童和成人急性B淋巴細胞白血病(ALL)治療臨床試驗中取得驚人的效果。在費城兒童醫院的Stephan Grupp 博士主導的臨床試驗中，90%的ALL病人輸入CAR-T細胞后實現完全緩解 (數據來源The New England Journal of Medicine, DOI: 10.1056/NEJMoa1407222)。

CAR-T細胞療法的發展歷史

2017年對CAR-T細胞療法而言，無疑是具有里程碑意義的一年。

8月，諾華的tisagenlecleucel (Kymriah) 經FDA全票通過被批准用於兒童及青年急性淋巴性白血病治療。

同年10月，FDA批准第二個CAR-T細胞療法，Gilead旗下公司Kite製藥產品axicabtagene ciloleucel (Yescarta)，用於瀰漫性大B細胞淋巴瘤治療。隨著這兩個CAR-T產品的成功獲批，腫瘤治療正式進入新紀元。

賓夕法尼亞大學醫學院慶祝Kymriah獲得FDA批准的場景

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CAR-T 細胞的抗腫瘤機理

在結構上，CAR由胞外的單鏈抗體（scFv）區域、跨膜區域、胞內的T細胞活化信號域（通常是CD3ζ鏈）和協同刺激信號域（CD28, 41BB, OX40等）組成。

不同於普通T細胞通過T細胞受體（TCR）識別抗原，CAR-T細胞通過胞外的scFv識別腫瘤細胞表面的腫瘤相關抗原（TAA），而不受主要組織相容性複合體的限制。

第一代CAR僅有來自CD3ζ鏈的活化信號，當scFv 識別到TAA后將信號轉入胞內，由CD3ζ信號引發T 細胞的激活。在第二代、第三代CAR中加入的協同刺激信號進一步增強了T的增殖能力、腫瘤細胞殺傷能力和分泌細胞因子的能力（IL-2, TNFα, IFN-γ等）。

CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞的機理主要包括：（1）分泌穿控素和顆粒酶B; (2) 通過 Fas/Fas配體或TNF/TNF受體激活死亡受體信號。

第二代CAR結構

圖片來源：Juno Therapeutics

CAR-T 細胞療法臨床研究現狀

近年來，CAR-T 細胞療法相關的研究飛速發展，在針對血液腫瘤的成功案例鼓舞下，利用CAR-T治療實體瘤也在巨大的挑戰中穩步前行。

隨著生物醫藥產業對這一領域的重視程度越來越高，基於CAR-T 細胞療法的臨床試驗數量持續增加。目前在美國clinicaltrials.gov網站註冊的CAR-T 細胞療法用於腫瘤治療的臨床試驗有近300個。

A）靶向血液腫瘤抗原的 CAR-T 細胞療法

目前為止，大多數臨床試驗還是關於靶向B細胞抗原分子CD19的CAR-T 細胞療法的研究，但這種狀況正在改變。

比如，部分ALL病人不能對CD19 CAR-T 細胞產生響應，或者在完全響應后的一年內由於ALL細胞的CD19抗原丟失而病情複發。

針對這個問題，研究人員把目光轉向了另一個在ALL細胞表面過表達的抗原分子CD22。在首個靶向CD22的 CAR-T細胞療法臨床試驗中，73%的病人實現完全緩解，其中包括接受CD19 CAR-T 細胞療法后複發的病人 (數據來源nature medicine doi: 10.1038/nm.4441, 臨床試驗代碼：NCT02315612)。

但實際上，CD22 CAR-T細胞療法治療后疾病複發的現象也並不罕見。為了提高CAR-T 細胞療法緩解ALL的持久性，避免由於抗原丟失而導致的疾病複發，多個團隊採用了同時靶向兩個抗原的研究策略。

例如，同時靶向CD19和CD22的CAR-T細胞療法正在進行早期臨床試驗，同時靶向CD19和另一個常見的ALL過表達抗原CD123的CAR-T細胞療法在動物模型中被證明可以有效防止抗原丟失。

CD123同時也是難治性血液腫瘤的重要靶點。日前在美國希望之城國家醫療中心進行的CD123 CAR-T 細胞療法I期臨床試驗證明了該種療法在急性骨髓性白血病（AML）和胚胎漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤(BPDCN)治療中的應用潛力。

在骨髓瘤的治療研究中，B細胞成熟抗原（BCMA）因其在B細胞上表達的特異性逐漸成為一個明星靶點。

今年8月，Kite製藥針對多發性骨髓瘤的BCMA CAR-T細胞療法臨床試驗得到 FDA批准。12月，ASCO的一匹黑馬「南京傳奇」遞交了中國首個CAR-T細胞藥物臨床申請，其治療策略也是利用BCMA作為靶點。最近，Celgene和BlueBird生物公司聯合開發的針對複發或難治多發性骨髓瘤的BCMA CAR-T細胞療法更是獲得FDA突破性療法認定。

目前，多個基於BCMA CAR-T細胞療法的臨床試驗正在進行中，預示著BCMA靶點可能成成為CAR-T的下一個金礦。

B） 針對實體瘤抗原的CAR-T 細胞療法

CAR-T 細胞療法在血液腫瘤治療中取得的空前成功激勵著人們把這一技術擴展應用到實體瘤上，越來越多的針對實體瘤抗原的CAR-T 細胞療法臨床試驗相繼開展。

例如，通過靶向癌胚抗原(CEA)治療結直腸腺癌，通過靶向成纖維細胞活化蛋白(FAP)治療惡性胸膜間皮瘤，通過靶向神經節苷脂 GD2治療神經母細胞瘤，通過靶向間皮素治療胰腺癌，通過靶向表皮生長因子受體(EGFR)治療非小細胞肺癌等。

已完成和正在進行的CAR-T 細胞療法臨床試驗

圖片來源：Oncotarget

然而，臨床試驗的結果卻往往不盡如人意，CAR-T 細胞療法用於實體瘤的治療效果遠不如血液腫瘤，且常伴隨毒性。

這種差異由多種因素造成：

（1）血液腫瘤細胞是分散的，而實體瘤在早期通常會在某個器官形成較為堅實的團狀物，不但給免疫細胞的進入造成了重重障礙，其間還有多種具有免疫抑制作用的細胞和分子；

（2）血液腫瘤細胞攜帶腫瘤相關抗原的水平相近，而實體瘤細胞的抗原表達水平在不同腫瘤類型之間，以及同種類型腫瘤的不同階段之間均有差異；

（3）血液腫瘤的抗原具有特異性，在其他正常組織沒有表達，而針對實體瘤的抗原一般在其他部位，如心臟、肺、肝臟等有少量表達，這就伴隨了治療的脫靶效應。

CAR-T 細胞療法應用於實體瘤治療的挑戰和解決方案

A）CAR-T細胞轉運和腫瘤浸潤

相較於血液腫瘤，實體瘤可以分泌趨化因子如CXCL12和CXCL5，阻止CAR-T細胞抵達腫瘤。同時，實體瘤細胞分泌極少幫助CAR-T細胞轉運的CXCR3 和CCR5配體。這兩個因素使 CAR-T細胞到達實體瘤部位的路途困難重重。

為了和腫瘤細胞分泌的趨化因子更好地配對，有研究通過基因改造在CAR-T細胞上引入相關的趨化因子受體，如CCR2b，藉助腫瘤細胞大量分泌的CCL2幫助轉運。

也有研究改造能夠感染和溶解腫瘤細胞溶瘤病毒，使其能夠分泌趨化因子CCL5，和CAR-T細胞表達的受體CCR5配對，引導CAR-T細胞到達腫瘤。

實體瘤的另一個特點是在基質細胞中含有大量的腫瘤相關成纖維細胞。這些細胞通過分泌膠原蛋白，形成緻密的腫瘤組織，導致腫瘤內異常升高的間質壓，成為阻擋CAR-T細胞浸潤的物理屏障。

有研究表明，通過使用靶向成纖維細胞活化蛋白（FAP）的CAR-T細胞，可以顯著殺傷腫瘤相關成纖維細胞，有效抑制腫瘤生長。另一個方法是使CAR-T細胞同時表達乙醯肝素酶，通過乙醯肝素酶降解腫瘤的纖維化細胞外基質，克服物理屏障。

B）具有免疫抑制性的腫瘤微環境

首先，實體瘤內部普遍存在的低pH、低氧、營養貧乏的狀態非常不利於CAR-T細胞的存活和活化。

許多研究在實體瘤病人的組織提取物中還發現部分可溶性分子具有也免疫抑制性，例如腫瘤細胞和巨噬細胞分泌的前列腺素E2 (PGE2)，腫瘤細胞和髓源抑制性細胞（MDSC）分泌的吲哚胺2,3-二氧化酶（IDO），以及多種細胞在低氧環境下產生的ATP代謝產物腺苷。

目前的解決思路主要是將CAR-T細胞和針對這些分子或其受體的抑製劑聯用，從而減輕來自於他們的抑制性作用。

另一部分抑制性信號來自於實體瘤部位的細胞因子，其中以轉化生長因子β（TGFβ）的抑制作用最為明顯。

TGFβ可以促進調節性T細胞的成熟，並且抑制CAR-T的細胞殺傷能力。通過使用可溶性TGFβ受體或抗體進行系統給葯的方法已經在動物模型中被證明可以顯著提高CAR-T細胞療法效果。

在前文中已有提及，在實體瘤部位有多種免疫細胞在對CAR-T細胞的抑制作用中扮演著重要的角色，如調節性T細胞、髓源抑制性細胞、M2型腫瘤相關巨噬細胞、N2型腫瘤相關中性粒細胞。

髓源抑制性細胞、M2型腫瘤相關巨噬細胞、N2型腫瘤相關中性粒細胞可以生成TGFβ、PGE2、活性氧，直接抑制CAR-T細胞功能，其中髓源抑制性細胞還有很高的PD-L1表達水平，可以和CAR-T細胞表面PD1分子結合，引發抑制性信號。調節性T細胞抑制CAR-T細胞功能的機理則是通過分泌TGFβ和細胞因子IL-10。

具有免疫抑制性的免疫微環境

圖片來源: Molecular Therapeutics

C）CAR-T細胞的自我調節機制

在免疫耐受中起重要作用的T細胞表面分子CTLA4和PD1 等在CAR-T細胞被抗原激活后，通過和相關配體結合，抑制CAR-T細胞的增殖和細胞因子分泌功能。

特別是在腫瘤浸潤CAR-T細胞上，這些抑制性分子表達進一步上調，其介導的下游信號大大限制了CAR-T細胞在實體瘤部位的抗腫瘤免疫效應。

多個研究已經表明，使用這些受體的抑製劑可以增強CAR-T細胞療法的治療效果。

例如，HER2 CAR-T細胞和mesothelin CAR-T細胞與PD1抑製劑的聯用均在動物實驗中表現出顯著增強的抗腫瘤效果。也有研究使CAR-T細胞表達PD1開關受體，通過將PD1的胞外部分與激活性受體的胞內部分融合，逆轉抑制信號為激活信號。

除了表面抑制性受體上調外，CAR-T細胞受抗原刺激后也會激活一系列的負反饋信號通路，主要包括一些酶，如二醯甘油激酶（DGK）、磷酸酶、泛素連接酶等，和一些轉錄因子，如DNA結合蛋白Ikaros等。目前有很多臨床前和臨床研究嘗試通過抑制這些分子增強CAR-T細胞的功能。

D）CAR-T細胞的脫靶效應

CAR-T細胞對腫瘤細胞殺傷作用主要依賴於對腫瘤相關抗原（TAA）的識別。這些抗原常常過表達在腫瘤細胞表面，但在其他正常組織細胞上也有一定程度的表達。CAR-T細胞攻擊表達TAA的正常細胞的現象被稱為脫靶效應。

這種脫靶效應在實體瘤治療中非常常見，並導致了嚴重的毒副作用。因此，通過不同策略提高CAR-T細胞療法的特異性和安全性對之後在實體瘤治療中成功應用至關重要。

有研究團隊將CAR-T細胞胞內的活化信號和協同刺激信號進行拆分，分別連接胞外識別兩個不同抗原的單鏈抗體。僅當識別到同時表達兩種抗原的細胞（通常是腫瘤細胞）時，CAR-T細胞才能得到充分的激活。

或者，在常規CAR-T細胞的基礎上，引入一個能識別正常細胞表面分子並引發抑制性信號的CAR，由此避免CAR-T細胞在正常組織部位被激活 。

通過拆分受體提高CAR-T細胞對腫瘤細胞選擇性識別的策略

圖片來源：Trends in Immunology

另一個方法是調節CAR對TAA的親和性，使得CAR-T細胞能夠區分TAA高表達的腫瘤細胞和TAA低表達的正常細胞，僅能在腫瘤部位被激活。

藥物設計中前體藥物的策略也為這個問題的解決提供了新的思路，有團隊在CAR的scFv上游引入能掩蔽scFv抗原結合區域的多肽序列，並通過蛋白酶敏感的序列和scFv連接。由於實體瘤部位常有豐富的蛋白酶為腫瘤細胞的存活和轉移提供方便，CAR-T細胞到達實體瘤部位后其蛋白酶敏感序列可以被切斷，掩蔽多肽序列失去連接脫離scFv，CAR-T細胞因此恢復正常的抗原識別能力被激活。

CAR-T 細胞療法應用於實體瘤治療的未來展望

CAR-T 細胞療法自誕生以來就被寄予厚望，儘管目前在實體瘤的治療中還未取得令人滿意的效果，隨著我們對腫瘤環境以及影響CAR-T 細胞抗腫瘤作用影響因素的研究越來越透徹，這一領域一定會得到長足發展。

前文已經對克服實體瘤治療障礙的各種策略進行了小結，聯合治療是CAR-T 細胞療法未來發展的必然選擇，目前已有許多臨床試驗在如火如荼進行，旨在針對不同的適應症篩選出最佳的藥物聯用方案。同時，隨著誘導性多功能幹細胞技術被引入CAR-T 細胞的製備，敲除TCR的細胞毒性CAR-T細胞的大規模生產也成為可能。

一路荊棘與鮮花相伴，希望CAR-T 細胞療法這輛小車可以繼續駛向遠方。

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［11］ https://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/42462/title/The-CAR-T-Cell-Race/

［12］ https://immuno-oncologynews.com/2017/12/12/city-hope-car-t-cell-therapy-study-results-blood-cancer/

［13］ https://endpts.com/fda-ema-put-a-star-car-t-from-bluebird-and-celgene-on-the-vip-list/

本期作者：Sharon Chen

本科畢業於北京大學，現南加州大學藥學博士在讀，主要從事CAR T細胞療法用於實體瘤治療的研究。目前擔任美柏研究員。

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