2017年，在我們的生物領域內一名「網紅」如火箭般迅速竄起，出現在我們視野當中，他可以說生物領域內當之無愧的一匹「黑馬」——他就是CRISPR/Cas9基因編輯技術。CRISPR/Cas9基因編輯技術早前已經在部分領域應用，而在張峰教授張的憑藉對基因修飾技術CRISPR-Cas9的發展和應用研究獲得了美國專利之後，CRISPR/Cas9基因編輯技術更是是收到業內熱捧！

目前一些生物公司已成功CRISPR/Cas9技術應用到實驗當中，並形成一系列的產品和服務，如：廣州往聖生物公司的OneShine CRISPR/Cas9基因過表達細胞文庫。

然而，對於我們這些研究人員來說，比較關心的是，目前CRISPR/Cas9基因編輯技術有哪些成功的技術應用？這些技術又如何應用到實驗中？

以OneShine CRISPR/Cas9基因過表達細胞文庫為例：

1）OneShine CRISPR/Cas9基因過表達細胞文庫原理

此系統包括lentiSAMv2質粒和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro質粒。lentiSAMv2質粒如圖一所示，其中，eSpcas9(1.1)也叫做dCas9，是將Cas9酶切位點突變后形成的，它只具有結合基因組和sgRNA的能力，而不具備切割DNA的能力。lentiSAMv2質粒的sgRNA經過改造，在sgRNA後面加入了19個鹼基（MS2 binding site）。這19個鹼基經過轉錄后形成一個具有莖環結構的RNA，此RNA能特異性地與MS2蛋白結合。而在另一個載體lenti MS2-P65-HSF1_Hygro質粒上，MS2蛋白已經與P65、HSF1蛋白融合。其中，P65、HSF1是兩個轉錄因子。因此，當兩個載體同時進入同一個細胞后，lentiSAMv2質粒表達「sgRNA- MS2 binding site「融合RNA及dCas9蛋白，lenti MS2-P65-HSF1_Hygro載體表達MS2-P65-HSF1融合蛋白。在dCas9作用下，則形成「基因組DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2- P65-HSF1」這一超級複合體。當sgRNA為轉錄起始位點時，此超級複合體定位於轉錄起始位點，由於P65、HSF1可以募集更多轉錄因子，因此可啟動轉錄，從而激活轉錄起始位點後面的基因表達。

將合成了7萬多個轉錄起始位點的sgRNA（對應2萬多個基因），分別載入lentiSAMv2質粒中，再把此7萬多個質粒混合起來，形成文庫。並且將此文庫整合到了細胞中，一個125c㎡細胞培養瓶中含有約10^8個細胞，每個細胞被激活一個基因，共約2萬個基因被激活，所以含有每個特定激活基因的細胞約有5000個（10^8/2萬）。

2）OneShine CRISPR/Cas9基因過表達細胞文庫參數

靶基因物種：人

靶基因數目：23,430

gRNA數目：70,290

細胞類型：胃癌、乳腺癌、結腸癌等癌細胞系和永生化的細胞系。

3）OneShine CRISPR/Cas9基因過表達細胞文庫應用

【細胞凋亡相關基因篩選實驗】

取細胞文庫進行擴增，然後平均分成兩份，每一份包含10^8個細胞，每個細胞被激活了一個基因，共約2萬個基因被激活，所以含有每個特定激活基因的細胞約有5000個（10^8/2萬）。向其中一份細胞中加入放線菌素D、誘導細胞凋亡（A組），在另一份細胞中加入溶劑、作為對照（B組）。A組用流式細胞儀篩選出凋亡細胞A1、未凋亡細胞A2。B組用流式細胞儀篩選出凋亡細胞B1、未凋亡細胞B2。分別對A1、A2、B1、B2進行短測序，檢測哪些基因被激活了。A2中被激活的細胞即為能抵抗凋亡的基因，B1中被激活的基因即為能誘導凋亡的基因。其它應用：

（1）新葯靶點確定與驗證

（2）環狀RNA上游調控機制分析、下游調控機理分析

（3）Long noncoding RNA作用機制驗證

（4）脂肪代謝機制研究

（5）幹細胞自我更新、不對稱性分裂機制等。

OneShine CRISPR/Cas9基因過表達細胞文庫，可以說是CRISPR/Cas9技術的一次成功應用，類似CRISPR/Cas9技術的應用並不少見。隨著CRISPR/Cas9技術的不斷成熟，CRISPR/Cas9技術應用將會越來越廣泛。而對於我們來說，CRISPR/Cas9技術是新興的，時間是緊蹙的，內心是迫切的，腳步是急促的，我們當攜手共進，迎著CRISPR/Cas9技術時代浪潮奮勇向前。