過度自噬介導心肌肥厚心功能不全

桂亞利　余鵬　張陽陽　塗飛　吳軍　劉莉　丁正年

【摘要】目的　研究自噬在心肌肥厚心功能不全中的作用。方法　採用前期構建的心肌肥厚心功能失代償的熱休克蛋白27 轉基因鼠(heatshock protein transgenic mice，Hsp27 Tg)模型(4周齡、雌性)，隨機分為(1)自噬抑制(WM)組：自噬抑製劑渥曼青霉素(wortmannin，WM)溶於DMSO 溶劑，以1 mg/kg腹腔注射；(2)溶劑組：等體積的DMSO 溶劑腹腔注射，連續3～7 周齡。選取年齡、性別匹配的野生型對照鼠(wildtype，WT)作為WT 組。於注射WM 前、后，測定心臟質量/體質量比值(heart weight/bodyweight，HW/BW)，以二維超聲心動圖測定心功能，以免疫印跡方法測定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和p62水平以評價自噬水平。結果　(1)與WT組相比，4周齡Hsp27 Tg 鼠HW/BW 顯著增加，而心臟射血分數(ejectionfraction，EF%)和短軸縮短率(fraction shortening，FS%)均顯著下降(P＜0.01)；(2)與WT組相比，4 周齡Hsp27 Tg鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，而p62水平下降(P＜0.01)；(3)與溶劑組比較，注射3 周后的WM 組Hsp27Tg 鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平下降，而p62 水平升高(P＜0.01)；(4)與溶劑組比較，WM 注射3 周Hsp27Tg 鼠的心臟EF%、FS%均顯著增加(P＜0.01)。結論　WM 通過抑制自噬水平改善Hsp27高表達誘導的病理性心肌肥厚心功能不全，提示過度自噬介導了心肌肥厚心功能不全的進展，為進一步探究心肌肥厚失代償階段的發病機制提供理論基礎。

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【關鍵詞】心肌肥厚；自噬；渥曼青霉素

[中圖分類號]　R 542

[文獻標識碼]　A

doi：10.3969/j.issn.1003-9198.2016.05.006

基金項目：國家自然科學基金項目(81370260)

作者單位：210029江蘇省南京市，南京醫科大學第一附屬醫院麻醉科(桂亞利，丁正年)；老年心血管病科(余鵬，張陽陽，塗飛，吳軍，劉莉)

通訊作者：丁正年，Email：[email protected]

心肌肥厚是心臟對血流超負荷的一種代償反應，早期階段心肌細胞體積增大、肌節增多，心功能代償性增強，進一步發展為病理性心肌肥厚，心臟纖維化增加、心肌細胞能量代謝紊亂、心肌細胞壞死或凋亡，心功能失代償，最終轉化為心力衰竭(心衰)。病理性心肌肥厚作為心衰的前驅病變，是多種心血管疾病的獨立危險因子[1]。心肌組織內ATP合成減少有效促進自噬活性升高，持續的自噬激活進一步加重線粒體損傷，從而導致心臟結構和功能異常[2]。但自噬在心肌肥厚失代償階段的作用尚有待闡明。本研究擬採用前期構建的心肌肥厚心功能失代償的熱休克蛋白27轉基因鼠(Hsp27Tg)模型[3]，觀察自噬抑製劑渥曼青霉素(wortmannin，WM)對心功能不全發生髮展的影響，探索自噬在病理性心肌肥厚失代償階段中的作用。

1　材料與方法

1.1　實驗動物與試劑　本實驗所用Hsp27 Tg 雌鼠和性別匹配的同背景野生型(wildtype，WT)鼠均由南京大學模式動物研究所提供，並飼養於模式所內SPF 級動物房。自噬相關蛋白LC3 和p62單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 和馬抗兔IgG購自美國Vector 公司。

1.2　分組和給藥方式　將4 周齡的Hsp27 Tg 鼠分為2 組：(1) WM 組：WM先溶於DMSO，使用時用0.9%NaCl 稀釋，每天早晨9 點進行腹腔注射WM(1 mg/kg)；(2) 溶劑組：取等體積DMS溶劑進行腹腔注射。連續給葯3周后斷頸處死動物后，迅速鑷取心臟置於冰的磷酸鹽緩衝液中，快速去除心腔中血液和心房，用乾淨濾紙吸干水分後放置於－80℃冰箱中保存。

1.3　心肌肥厚檢測各組小鼠稱量體質量后，迅速處死後直接取出心臟稱量心臟質量並通過遊標卡尺測定脛骨長度，然後計算各組心臟質量/體質量比值(heatweight/body weight，HW/BW)。

1.4　心功能檢測　各組小鼠充分麻醉后，行常規超聲心動圖(VisualSonicsVevo770 超聲系統)檢測。用刀片在各組小鼠胸前區備皮，麻醉后選擇小鼠心率維持＞450次/min，以減少心率對射血分數(ejection fraction，EF)的影響。採用M 型超聲心動圖像，每隻小鼠至少檢測2次並連續採集5 個心動周期的參數，取均值用於統計比較。

1.5　Western blot 檢測蛋白表達　將－80 ℃保存心臟取出，加入400 μl組織裂解液，電動勻漿器以945 r/min 勻漿3 次，每次8 s。於4 ℃，24170 r/min，離心20 min后吸取上清。通過BCA 法測定蛋白溶度[4]，校正後在上清中加了緩衝液煮沸5min。然後進行電泳，電泳結束后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(poly vinyli denefluoride，PVDF)膜上，5%脫脂牛奶4 ℃ 孵育1 h 后，分別加入LC3(1∶1000)、p62(1∶1000)一抗4℃過夜，次日用TBST(NaCl 8 g、ＫCl 0.2 g、Tris base 3 g、加入濃鹽酸調pH至7.4，加雙蒸水至1L，最後加入0.1%tween20)洗膜3 次，每次10 min，室溫下加入相應二抗(1∶20000)孵育2～3h；再用TBST 洗膜3 次，每次10 min，最後通過ECL 顯影、曝光。利用AlphaEaseFc分析軟體測定條帶灰度值，並以內參GAPDH 進行對比標化。

1.6　統計學處理　採用SPSS 17.0 統計軟體分析數據。計量資料用均數±標準差(±s)表示，2 組間均數比較用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1　4 周齡Hsp27 Tg 鼠出現心肌肥厚　4 周齡的Hsp27 Tg 鼠和WT小鼠心臟大體形態見圖1A，可見Hsp27 Tg 鼠心臟體積顯著＞WT 鼠，經過測定，Hsp27Tg 鼠HW/BW 顯著高於WT鼠，增加了37.3%(P＜0.01，圖1B)。

2.2　4 周齡Hsp27 Tg 鼠出現心功能不全　超聲心動圖測定4周齡小鼠的結果顯示：與WT 組比較，心臟肥大的Hsp27 Tg 鼠的EF%和FS%分別下降了14.9%、18.4%(P＜0.01)。見圖2。

2.3　心肌肥大Hsp27 Tg 鼠心肌組織中自噬水平升高　4 周齡WT 和Hsp27 Tg組心肌Western blot 檢測結果顯示：與WT 組比較，Hsp27 Tg組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著上調了557.9%，p62 蛋白水平降低了41.4%(P＜0.01)。見圖3。

2.4　WM 抑制心肌肥大Hsp27 Tg 鼠心肌組織中自噬水平與溶劑組比較，WM 處理3周的Hsp27 Tg 鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著下降了90.8%，p62蛋白水平升高了68.8%(P＜0.01)。見圖4。

2.5　WM 改善心肌肥大小鼠的心功能不全　超聲心動圖檢測顯示：與溶劑組比較，WM組的EF%和FS%分別增加了42.1%和51.8%(P＜0.01)，見圖5。

3　討 論

Hsp27 是小分子熱休克蛋白家族的重要成員之一，已被證明是重要的心臟保護性分子伴侶[5-6]。我們早期研究發現在Hsp27中度表達的轉基因小鼠可以有效抵抗內毒素的心臟毒性，改善內毒素血症所致的心功能不全[7]。然而在心肌肥厚患者中發現心肌組織中Hsp27表達水平與心肌肥厚的進展呈正相關，結合我們前期研究發現8 周齡時Hsp27 高表達的轉基因Tg10小鼠產生還原應激所致的病理性心肌肥厚，共同提示高表達的Hsp27 可以促進心肌肥厚發生[3，8]。在本實驗中，我們觀察發現4周齡的Tg 組小鼠已發生心肌肥厚和心功能不全。

自噬是細胞內長壽蛋白質和多種細胞器降解回收再利用的自主過程，而線粒體自噬則主要負責清除異常線粒體和線粒體相關蛋白。適當的自噬/線粒體自噬活性對於維持心肌細胞的能量代謝穩態是必不可少的[9]。然而，自噬/線粒體自噬的過度激活會通過非選擇性降解正常的線粒體和線粒體相關蛋白，進一步加重線粒體損傷和能量代謝障礙，形成能量紊亂的惡性循環，最終引起心臟結構和功能的惡化。本研究發現心肌肥大小鼠心肌組織中LC3-Ⅱ增加而p62水平下降，提示自噬的過度激活可能在病理性心肌肥厚心功能不全中發揮作用。為了驗證上述假設，本研究選用已被廣泛驗證的自噬抑製劑WM應用於心肌肥厚。已有文獻報道，WM 抑制Ⅲ型PI3Ｋ活性，是一種重要的自噬抑製劑。WM通過抑制自噬底物向溶酶體內的運輸發揮抑制自噬的作用，並且具有很高的選擇性。通過連續3 周的WM 腹腔注射，我們發現WM雖然沒有逆轉心肌肥厚的發生，但其有效抑制心肌組織內自噬活性，改善心肌細胞和線粒體損傷並提高心肌能量代謝水平從而減輕病理性心肌肥厚的進一步發展。

綜上所述，WM 能夠有效抑制Hsp27高表達所致病理性心肌肥厚模型中自噬活性，改善肥大性心臟的心功能不全，而阻止病理性心肌肥厚向心衰轉變，這為臨床延緩病理性心肌肥厚進展及心衰治療提供新靶點和新思路。然而，通過抑制自噬活性以達到保護線粒體和改善能量代謝的具體機制有待進一步實驗探討。

[參考文獻]略

來源：選自醫學空間戰略合作夥伴《實用老年醫學》2017年5月第31卷第5期，轉載請標明出處！

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