細胞培養基介紹，沒有這些基礎知識，別去禍禍細胞！

細胞培養基（cell culture medium）是人工模擬動物細胞的體內生長環境，維持體外細胞存活和增殖的營養物質基礎，其主要功能是為細胞提供適宜的pH和滲透壓，以及細胞本身不能合成的各種營養物質。本文將對細胞培養基的種類、成分及理化性質，以及相關問題等方面進行介紹。

1. 細胞培養基的種類

按照細胞培養基的發展歷史，細胞培養基大致可分為平衡鹽溶液、天然細胞培養基、合成細胞培養基、無血清細胞培養基、限定化學成分細胞培養基等幾大種類。

1.1平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS）

BSS主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養。其主要用於細胞的漂洗、配製其他試劑等。幾種常用的BSS配方如下（表1-1）。

D-Hank's與Hank's的一個主要區別是前者不含有Ca2+和Mg2+，因此D-Hank's常用於配製胰酶溶液。因為Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成份，參與細胞粘附等功能，使用不含Ca2+、Mg2+的BSS可避免細胞結團。此外，Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎溶液，前者緩衝能力較弱，適合於密閉培養；後者緩衝能力較強，適合於5% CO2的培養條件。

表1-1 幾種常用的BSS配方（g/L）

1.2天然細胞培養基

天然培養基指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。其優點是營養成分豐富，培養效果良好，但缺點是成分複雜，來源受限且製作過程複雜、批間差異大。目前廣泛使用的天然培養基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少。

水解乳蛋白是乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含豐富的多肽、氨基酸和碳水化合物。一般配製成0.5%溶液（採用平衡鹽溶液溶解）與合成培養基（如MEM細胞培養基）以1:1的比例混合使用。

目前用於細胞培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的，但並不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。此外，血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。目前，血清多作為一種添加成分與合成培養基混合使用，使用濃度一般為5 ~ 20 %，最常用是10 %。

由於水解乳蛋白和血清成份複雜，批間差異大及存在病毒等外源污染風險，對下游生物製品的分離純化和安全性都存在較大的影響，在生物製藥行業的使用也越來越少。因此，基於對血漿成份的分析，合成細胞培養基應運而生。

1.3合成細胞培養基

合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、配製的培養基。最早開發的基礎培養基（minimal essential medium, MEM），其本質為含有鹽、氨基酸、維生素和其他必需營養物的pH緩衝的等滲混合物。在此基礎上，DMEM、IMDM 、HAM F12、PRMI1640等各種合成細胞培養基被不斷開發出來。常用合成培養基的配方此處不詳細介紹，其特性及應用的範圍見表1-2。

表1-2常用合成培養基的特性及應用的範圍

與天然培養基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學成分所替代，因此，細胞培養中使用合成培養基時必須加入一定量的天然培養基成分，以克服合成培養基的不足。最普遍的做法是添加5~10%的血清，這樣才能維持細胞活力，促進細胞增殖。針對不同的動物細胞，現已開發了多種商業化、個性化的低血清細胞培養基配方，營養成份更加豐富，血清使用量可降低至1～3%，由此可減少了血清等動物來源成份對生物製品安全性的影響。

1.4無血清細胞培養基（serum free medium，SFM）

經歷了天然培養基、合成培養基后，無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。採用無血清培養可降低生產成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。無血清培養基，一般是在合成培養基的基礎上，加入成份完全明確的或部分明確的血清替代成份，達到既能滿足動物細胞培養的要求，又能有效克服使用血清所帶來問題的目的。

無血清培養基中通常需要添加一些額外的組分，才能幫助細胞貼壁生長，包括以下幾大類物質：

1）促貼壁物質：一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

2）促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

3）酶抑製劑：培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中需含酶抑製劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑製劑。

4）結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。

5）微量元素：硒是最常見的。

1.5無蛋白無血清細胞培養基與化學組份限定無血清細胞培養基

① 無蛋白無血清細胞培養基（protein free midium,PFM）

這類培養基完全不含有動物來源蛋白，但仍有部份添加物是植物蛋白的小水解片段或合成多肽片段，以及類固醇激素和脂類前體等，以替代動物激素、生長因子的作用。其特點是完全沒有蛋白或蛋白含量極低，有利於生物製品的分離純化。

④化學組份限定無血清細胞培養基（Chemically defined media, CDM）

此類培養基是目前最安全、最為理想的無血清細胞培養基，所有成份的濃度都完全明確，即使其所添加的少量蛋白，也是可經過純化處理，成份明確、濃度確定的蛋白。這類培養基較為理想地減少了生產的可變性，提高了生產工藝的重複性，並有效降低了純化成本。

1.6個性化細胞培養基

嚴格意義上來說，個性化細胞培養基不在細胞培養基的傳統分類之列，其具體是指一類根據細胞特性、細胞培養工藝特點、使用者需求習慣而量身定製的細胞培養基，主要目的是提高細胞產率、產品質量、產品安全性和降低血清的使用等。個性化細胞培養基可能是無血清培養基，也可能是低血清培養基，最終是為滿足某一種或某一類生物製品的生產需求。

2. 培養基的基本組分

細胞培養基必須含有充分的營養物質，才能滿足新細胞合成、細胞代謝等生化反應所需要的物質和能量。細胞培養基的主要成份是水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助營養物質等。此外，還可能含有血清、血清替代成分、pH指示劑等。

2.1水

水是細胞的主要成份，也是細胞賴以生存的主要環境。細胞培養液中90%以上的成份是水。細胞對水的品質非常敏感，水的品質將直接影響細胞培養的效果。而水中通常含有重金屬、氯、磷、有機物、熱原等污染物，細胞培養用水須經過純化，品質應符合中國藥典注射用水標準或者超純水的標準。

2.2能源和碳源

能源和碳源是用於維持細胞生命和支持細胞生長，主要包括糖、糖酵解的產物和谷氨醯胺，其他氨基酸是次要的能源和碳源物質。細胞能夠利用的糖類主要是六碳糖，目前大多體外培養時選取葡萄糖作為細胞的主要碳源和能量來源，因此細胞培養基中基本都含有葡萄糖，含量一般為5～25mmol/L。

在葡萄糖濃度較高時，細胞主要通過擴散作用吸收葡萄糖，細胞膜內外的葡萄糖濃度梯度是細胞吸收葡萄糖的動力；在葡萄糖濃度較低時，主要由鈉離子推動的高親和性轉運過程使細胞攝取葡萄糖。葡萄糖進入細胞后參與糖酵解、核酸代謝、糖原合成、能量代謝以及一些氨基酸的合成。與體內的能量供應途徑不同，體外培養時，一定的濃度範圍條件下，葡萄糖主要經糖酵解循環轉化成乳酸來為細胞提供能量。

2.3氮源（氨基酸）

氨基酸在細胞內的重要生理作用主要體現在以下幾個方面：

① 是蛋白質的基本組成單位，用於合成蛋白質和多肽；

② 可用於合成某些具有重要生理作用的含氮化合物，如核酸、尼克醯胺等；

③ 某些氨基酸還具有獨特的生理作用，如甘氨酸參與生物轉化作用，丙氨酸和谷氨醯胺參與細胞內氨的運輸等；

④ 可轉變成糖類和脂肪，參與氧化供能。

細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構體，D型氨基酸不能被利用。不同的細胞對氨基酸的需求各異，但有些必需氨基酸是細胞不能自身合成的，必須依靠外源的細胞培養液提供。其餘非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或通過轉氨作用由其他物質轉化而來，但是在細胞培養基中添加適當濃度的非必需氨基酸可以減輕細胞在合成方面的負擔，提高谷氨醯胺及其它必需氨基酸的利用率。

絕大部分細胞對谷氨醯胺有較高的要求，可能因其不僅是細胞的主要氮源，且可作為細胞生長的能源物質和嘌呤、嘧啶核苷酸的前體，另外還可直接作為細胞增殖和產物合成中的蛋白質和多肽的組成成分。在缺少谷氨醯胺時，細胞會生長不良，甚至死亡。由於谷氨醯胺具有多種生理作用，體外動物細胞培養時需要大量谷氨醯胺，利用量常超過其他必須氨基酸利用量的總和。

2.4維生素

維生素是維持細胞生長的生物活性物質，在細胞代謝中起調節及控制作用。維生素可分為水溶性和脂溶性兩類，水溶性維生素主要包括泛酸、維生素B12、葉酸、煙醯胺、吡哆醛、硫胺素、核黃素、維生素C、膽鹼、肌醇等；脂溶性維生素主要包括維生素A、D、 E、K等；有的培養液中還直接採用ATP和輔酶A；大部分培養基中還有生物素。

許多維生素參與構成各種酶的活性基團的成分，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進行。比如，泛酸可以在細胞內轉變成醯基載體蛋白和輔酶（如輔酶A），參與糖類、脂類和蛋白質代謝中的催化反應；維生素B12則在細胞內參與葉酸的合成和脂肪酸的合成等。不同配方的細胞培養基中維生素的濃度有較大差異。例如，DMEM培養基中維生素的含量約為MEM培養基的兩倍，其原因是一方面不同種類維生素的作用不同，另一方面不同種類的細胞對維生素的需求也可能有較大差異，相應細胞培養基的配方中維生素的含量也可能不同。

2.5無機鹽

無機鹽是細胞維持生命活動所不可缺少的營養成分，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl－、PO43—、SO42—、HCO3－等，主要作用為維持細胞培養液滲透壓平衡，參與細胞的代謝活動。此外，通過提供鈉，K+和Ca2+，幫助細胞調節細胞膜功能。Na+是細胞外液中最主要的陽離子，對維持滲透壓的恆定有決定性的作用，還與Cl－共同參與生物電活動、維持水平衡和酸鹼平衡等。K+主要分佈在細胞內液，對於激活某些酶是必需的，並在調節細胞內環境的酸鹼平衡上也有極重要意義。Ca2+和Mg2+主要參與信號傳導、能量代謝、脂肪酸合成、核糖體穩定和蛋白質合成等多種生理作用。PO43－、SO42－、HCO3－是基質所需陰離子，同時是細胞內電荷的調節者。磷對於細胞的生長、代謝和調控都有重要的作用，含磷的化合物如核酸、磷脂、蛋白質是構成細胞的主要成分，ATP、ADP是能量生成、存儲和利用的不可或缺的化合物。

上述離子對於細胞的作用各有不同，它們共同構成了細胞賴以生存的滲透壓、pH和電化學平衡的微環境，細胞對於某種元素的吸收利用會受到其它元素的干擾，例如培養基中過高的鈣離子濃度會使鎂和鋅的吸收利用受到干擾。因此，在保證培養基中上述離子濃度滿足要求以外，還需保證上述離子之間種類和比例的平衡。

此外，微量元素如鐵、鈷、鎳、硒、碘、銅、鋅、錳、鉻、鉬、氟等對於細胞生長代謝和產物合成都有促進作用。微量元素在細胞內通常以與有機物結合的形式存在。其中鐵在細胞中參與氧的轉運；鈷是維生素B12的組成部分，參與葉酸的合成和脂肪酸的合成；鎳能夠激活脫氧核糖核酸酶、乙醯輔酶A合成酶等在細胞內具有重要功能的酶，還具有穩定核酸結構的功能；亞硒酸鈉中的硒，作為谷胱甘肽過氧化物酶的輔基，具有抗過氧化物能力，參與消除細胞內的脂肪酸過氧化物，提高細胞的生長速率和活性。

2.6其他添加成分

在低血清、無血清細胞培養基中，為滿足細胞生長增殖需要，常常添加一些成份：蛋白質、多肽、核苷、嘌呤、檸檬酸循環的中間產物、脂類、及一些血清替代因子等。其中蛋白質具有重要的作用，動物細胞對許多物質（難溶於水的離子或脂類物質）的攝取需要藉助蛋白質的傳遞作用，如白蛋白、傳遞蛋白、貼壁蛋白等能夠攜帶脂肪酸、激素、礦物質等促進細胞生長。轉鐵蛋白是一種重要的傳遞蛋白，能夠結合鐵，促進細胞對鐵離子的吸收，並具有解毒作用，其促生長作用可能與其具有生長因子的功能有關。胰島素可促進細胞對葡萄糖和氨基酸的利用，商業化中一些生長因子以重組蛋白形式添加到培養基中，主要用來刺激細胞增殖，並可促進糖元和脂肪酸的合成。乙醇胺是一種重要的刺激細胞生長的化合物，是腦磷酸的合成前提。

另外，酚紅作為pH值的指示劑被加入到細胞培養基中。酚紅在產物純化過程中會造成干擾，並且具有一定的固醇類激素樣作用，如雌激素樣作用。當用於哺乳類動物細胞的培養，可能會發生一些固醇類反應。現在商業化細胞培養基中的酚紅含量可根據需求調整。因生物反應器具有pH在線檢測技術，生物反應器培養動物細胞時，酚紅可完全去除。

2.7保護劑

細胞保護劑是保護細胞免受滲透壓變化、剪切力、氧化及氣泡作用等引起的損傷的物質。在使用生物反應器培養動物細胞時，細胞易被機械攪拌和通氣鼓泡產生的流體剪切力和氣泡作用所傷害甚至破損死亡。為降低這種損傷，除優化生物反應器結構和生產工藝外，可在細胞培養液中添加一些保護劑。其主要是通過改變細胞培養基物性或是對細胞具有保護作用的物質，常用的種類有血清、白蛋白、聚已二醇（PEG）、非離子性表面活性劑PluronicF68或是其他一些高分子聚合物等。

3. 細胞培養基的理化性質

動物細胞在細胞培養基中不僅能存活，還要分裂增殖，合適的滲透壓、pH值等理化性質是細胞培養基必須具備的前提條件。

3.1 pH

動物細胞大多數需要輕微的鹼性條件，適宜pH在7.2～7.4之間。細胞培養基的pH值通常需經校正的pH計來測定。在細胞生長過程中，隨細胞數量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養液變酸，pH值發生變化。酚紅是細胞培養基中最常用的pH指示劑，但依靠細胞培養基中的酚紅等pH指示劑進行判斷，需要實驗員的經驗積累，存在較大的主觀性。實際上，個性化細胞培養基或是無血清細胞培養基中酚紅含量較少或是不含酚紅，只能通過pH計或者pH電極進行pH值的檢測，結果更為準確可靠。

3.2 緩衝能力

細胞培養基應具有一定的緩衝能力。細胞培養過程中造成細胞培養液 pH 波動的主要物質是細胞代謝產生的CO2。在封閉式培養過程中CO2與水結合產生碳酸，細胞培養液pH 很快下降；打開培養器具時CO2逸出則會引起pH升高。細胞培養基通常採用NaHCO3-CO2緩衝系統，按下列化學反應方程式調節細胞培養基的pH值：

H2O + CO2→ H2CO3 ⇌ H+ + HCO3－

NaHCO3⇌ Na+ + HCO3－

此外，還有緩衝能力較高的磷酸鹽緩衝系統。但碳酸鹽緩衝系統的細胞毒性小、成本低，在細胞培養中應用得更為廣泛。另一種較為常用的緩衝液是HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）液，它是一種非離子兩性緩衝液，在pH 7.0 ~ 7.2範圍內具有較好的緩衝能力。高濃度的HEPES可能對細胞有毒性作用，細胞培養時HEPES的添加濃度一般為10～25mmol/L。

3.3 滲透壓

細胞必須生活在等滲的環境中，大多數體外培養的細胞對滲透壓有一定耐受性。研究顯示，對於大多數哺乳類動物細胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的範圍內都適宜。在生產、配製細胞培養基的過程中，滲透壓的測定較為重要，有助於防止在生產、配製過程中出現稱量等方面的錯誤。反應器高密度培養動物細胞過程，在添加碳酸氫鈉的過程中注意滲透壓的監控，防止滲透壓過高對細胞的損害。

3.4 溫度

溫度對細胞培養基有較大的影響，溫度過高可引起營養成份的降解或破壞，細胞培養基的pH、離子強度和電解常數pKa也可能受到影響。如細胞培養液中的谷氨醯胺，在高溫條件下降解的速度較快，如35 ℃貯存時，放置3天降解25%左右，在4 ℃貯存3周降解約20%。

3.5 粘滯性及表面張力

含血清細胞培養液的粘滯性主要是由血清引起的，在轉瓶培養貼壁細胞時，培養液的粘滯性對細胞生長沒有多大影響；但在生物反應器懸浮培養細胞時，細胞培養液的粘滯性則直接影響攪拌轉速控制及攪拌剪切力對細胞造成的損傷程度。

表面張力對細胞培養有較大的作用，尤其在利用生物反應器進行懸浮培養時，攪拌和通氣都會引起泡沫的產生。對於含血清培養液，由於血清中多種蛋白的存在，攪拌時產生的氣泡較多，氣泡的上升運動對細胞的損傷程度還有爭議，但氣泡的破裂對細胞有明顯的損傷作用。為降低這種損傷，可通過在細胞培養基中添加一些保護劑，降低細胞-氣體和細胞-液體的表面張力，減少氣泡的形成。

4. 細胞培養基的滅菌及儲存

4.1不同細胞培養基的除菌方式及注意事項

細胞培養基滅菌的方式分為高壓滅菌和膜過濾除菌，不同的培養基由於其營養成份不同，滅菌方式也可能不同。

① 高壓滅菌

某些培養基（如MEM）可進行高壓滅菌，這類培養基一般不含有L-谷氨醯胺和碳酸氫鈉，一般是在培養基高壓滅菌后才加入。另外可用耐高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨醯-L-谷氨醯胺）代替L-谷氨醯胺。可高壓滅菌的培養基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達到滅菌效果及營養成分的最小損失，不需將滅菌時間延長。

絕大多數細胞培養基不適宜高壓滅菌。因培養液中常含有維生素、蛋白質、多肽、生長因子等物質，這些物質在高溫或射線照射下易發生變性或失去功能，因而上述液體多採用過濾消毒以除去細菌。可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone（PES）、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。膜過濾除菌是當前較為常用及便捷的一種方法，常採用0.2 μm孔徑的濾膜，部份採用0.1 μm孔徑。與高壓過濾方式相比，濾膜具有使用期限且價格較高，但對細胞培養基的營養成份破壞性較小。

4.2 不同細胞培養基存儲過程中的注意事項

通常液體細胞培養基避免-20 ℃凍存，因為解凍時可能會有營養成份析出，影響培養效果。正常情況下於2 ~ 8 ℃避光保存，使用前從冰箱取出，放入室溫進行平衡。通常的液體培養基有效期是6個月到12個月。液體細胞培養基盡量避免長期貯存，其中的谷氨醯胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解，如果細胞生長不良，可考慮檢測培養基中的谷氨醯胺含量確定是否再補加谷氨醯胺。市售商業化液體細胞培養基有具體的有效期，對於使用乾粉細胞培養基自行配製成液體以後，也應低溫（2 ~ 8 ℃）貯存。除培養基中如谷氨醯胺易降解之外，培養基中的其他成份隨著溫度的升高也可能會發生降解或是析出。

5. 細胞培養基使用過程中常見問題分析

5.1細胞培養基的緩衝系統選擇及pH變化問題

由於大多數細胞適宜的pH為7.0~7.4，偏離此範圍可能對細胞生長產生有害的影響。但各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養的細胞一般對pH變動耐受力差，無限細胞系耐受力強。因此，原代培養時，培養液中的緩衝系統就顯得較為重要。一般的細胞培養基採用的都是平衡鹽系統，但不同的培養基或是同一系列的培養基所用平衡鹽系統不同，如199系列、MEM系列均有Hanks』系統的培養基及Earle』s系統的培養基。有些培養基不是上述常規的平衡鹽系統，例如RPMI1640培養基、F12培養基。MEM低血清培養基的平衡鹽系統也不是常規的平衡鹽系統，該平衡鹽系統的緩衝能力強於常規平衡鹽系統的緩衝能力。

細胞培養過程中pH值下降產生的原因有很多。在細胞生長非常快時，pH值通常下降得很快，此時可以通過及時傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進行解決。此外，培養瓶蓋擰得過緊、NaHCO3緩衝系統緩衝能力不夠、培養液中鹽濃度不正確、細菌、酵母或真菌污染等也能導致pH值通常下降得很快。這時，可以通過以下幾種方法解決：

1）增加培養液中NaHCO3濃度或減少培養箱內CO2濃度。NaHCO3含量在2.0g/L到3.7g/L之間時對應的CO2濃度為5~10%；

2) 改用不依賴CO2培養液；

3) 適當鬆開瓶蓋。在培養液中加HEPES緩衝液，使終濃度為10~25mM；

4) 在CO2培養環境中改用基於Earle』s鹽配製的培養液，在大氣培養環境中培養改用Hanks』鹽配製的培養液；

5) 如果是污染造成的則丟棄培養物或用抗生素除菌。

5.2細胞培養基常用幾種重要的添加成份及使用過程中應注意的問題

酚紅在細胞培養基中用作pH值的指示劑。一般情況下，可以通過酚紅的指示作用判斷培養基的pH值，但低血清或是無血清細胞培養基中酚紅的含量與普通細胞培養基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經驗來判定pH值，建議使用pH計進行測定。酚紅通常對含血清的細胞培養基生產的生物製品質量並不會產生明顯影響，也可通過純化技術去除，但酚紅在無血清細胞培養基中可能帶來胞內鈉/鉀失衡，影響細胞生長。

碳酸氫鈉在細胞培養基中主要是作為緩衝系統，此外還具有調節滲透壓的作用。通常產品使用說明中的碳酸氫鈉推薦量是一個標準、安全量，是在科學的基礎上根據實踐經驗所得。但是由於不同的細胞系（株）不同，同一株細胞適應環境也可能不同（細胞耐受性不同等），且存在的地域性水質差異等，在實際生產過程中也可稍作改動，但使用者需做相應的檢測（理化及細胞生產試驗等）。

HEPES是一種非離子緩衝液，在pH 7.2 ～7.4範圍內具有較好的緩衝能力，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES緩衝液可與低水平的碳酸鈉（0.34 g /L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。其安全濃度範圍是10～25 mmol/L。

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，儘管細胞更傾向於以葡萄糖作為碳源，但是在沒有葡萄糖的條件下，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

谷氨醯胺在溶液中很不穩定，4 ℃下放置1周可分解50 %，使用中最好單獨配製，置-20 ℃冰箱中保存，使用前加入細胞培養液中。